卵母细胞人工激活治疗卵质内单精子注射受精失败的临床应用及研究进展▲

薛林涛 王世凯 覃 捷

(广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心，南宁市 530021，电子邮箱：ltxgxh@163.com)

【提要】 卵质内单精子注射(ICSI)技术是治疗男性不育的有效手段，但是ICSI周期完全受精失败的发生率为2%～3%，同时男性精子严重畸形仅采用ICSI治疗仍无法正常受精。卵子激活障碍是导致受精失败的最主要因素，而卵子辅助激活可以人工诱发钙振荡激活卵子，促进正常受精。近年来卵母细胞人工激活在临床中的应用越来越广泛，成为治疗ICSI受精失败的主要辅助技术，但该技术临床应用的安全性仍存争议。本文就人卵子辅助激活技术在ICSI受精失败中的临床应用现状及其研究进展进行综述。

卵质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术是通过显微操作将单个精子注入卵胞质内以完成受精，该技术的出现解决了男方及受精障碍等因素导致不育疾病的问题，是目前治疗男性不育最有效的技术手段。但ICSI周期中仍然有2%～3%的患者发生完全受精失败，ICSI后卵子的受精率约为70～80%，还有20%～30%的成熟卵子即使注射精子后仍无法受精，同时男性精子形态严重畸形(如圆头精子症)仅采用ICSI治疗仍无法正常受精。有研究发现，卵子激活障碍是导致ICSI受精失败的最主要因素[1]，而卵母细胞人工激活(artificial oocyte activation,AOA)技术能够成功诱发卵子钙振荡，激活卵子恢复第二次减数分裂促进受精完成，在圆头精子症[2]、反复ICSI受精失败[3]等患者中应用可以显著提高受精率，改善临床结局。目前AOA在辅助生殖助孕周期中的应用越来越广泛。本文就AOA的技术原理、临床应用及其研究进展做一综述。

1 ICSI受精失败的原因及机制

ICSI受精失败的原因主要分为卵源性和精源性两方面因素：(1)卵子质量是保证受精成功的前提，只有当卵母细胞质和细胞核同步成熟，才能对精子进入卵子后释放的因子发生充分应答，引发钙振荡，激活卵母细胞。有学者对受精失败的卵母细胞进行超微结构分析，发现卵母细胞染色体分布、纺锤体结构及其他细胞器分布异常，这提示卵母细胞核质不成熟或成熟不同步会导致受精失败[4]。另外，卵母细胞的基因功能缺陷也会导致受精失败，有研究发现，卵母细胞特异表达的蛋白激酶Wee发生纯合突变可导致受精失败[5]。(2)即使成熟的卵细胞在精子注射后也会发生受精失败，这种现象主要是由于精子未能成功诱发钙振荡激活卵细胞所致，目前认为精子磷脂酶C ζ(phospholipase C zeta，PLCζ)是诱发钙震荡的特异性因子[6]。精子中的PLCζ处于一种失活状态，精子与卵子融合时开始活化，PLCζ通过分解磷脂酰肌醇4,5-双磷酸(phosphatidylinositol-4,5-biphosphate,PIP2)产生肌醇1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)，IP3结合内质网上的特异性受体，诱导内质网的Ca2+释放，而Ca2+浓度的增加使PLCζ活性增强，进一步正反馈调节IP3及Ca2+的释放，使Ca2+浓度进一步升高，当Ca2+达到临界浓度时，通过Ca2+通道的调节，使胞质内的Ca2+恢复至基础水平，至此钙振荡的单个波峰形成。PLCζ的表达异常包括表型异常和功能异常，均会导致卵母细胞激活失败，同时，PLCζ的活性位点残基相对保守，其突变也可能导致PLCζ诱导Ca2+能力丧失[7]。但是有研究发现，PLCζ基因敲除雄鼠的生育力只是降低，并非完全丧失，这提示卵子中也可能存在其他替代信号通路在PLCζ缺失的情况下起部分激活卵子的作用[8]，这有待于进一步研究。

2 AOA治疗的技术原理及临床应用

自然受精时精子中的PLCζ等释放入卵子触发钙振荡，而AOA技术是通过电刺激或化学制剂等方式处理卵子，激发胞外Ca2+内流从而模拟自然受精激活卵子诱发钙振荡[9]，这可以在一定程度上弥补精卵激活障碍导致的缺陷，人工诱导卵子恢复第二次减数分裂，完成正常受精过程，从而提高受精成功率。

目前AOA技术在因男性不育因素如圆头精子症等所致的ICSI受精失败患者中应用广泛，Taylor等[2]研究发现，对于圆头精子症患者采用AOA技术可以克服精子顶体缺失无法激活卵子的缺陷，成功受精并获得活产胎儿。Sfontouris等[10]对ICSI受精失败的患者进行AOA治疗，发现其可以显著提高受精率，同时对于通过睾丸手术取精的精子来源的ICSI周期，应用AOA技术有助于改善受精结局[11]。Karabulut等[12]研究认为解冻的精子经ICSI后采用AOA治疗能够改善胚胎质量和临床结局，避免精子冻融导致的不利影响。另外还有研究采用胚胎延时摄影技术监测ICSI卵子第二极体的排出情况，以此作为早期受精成败的判断标准，对不能正常排出第二极体的卵子进行AOA治疗，结果发现该干预措施能够获得正常受精并获得理想的胚胎发育结局，并提高卵子利用率[13]。

近年来也有研究发现，AOA不仅能够改善激活障碍导致的受精失败，对于胚胎发育阻滞、反复周期胚胎质量差的患者可能也有一定的治疗作用。Darwish等[14]对ICSI受精后原核期发育阻滞的患者，在下一个治疗周期使用钙离子激活剂处理，结果发现受精卵可以突破阻滞进而正常分裂；Kashir等[8]认为对于胚胎发育阻滞、反复周期胚胎质量差或者反复植入失败的患者应用AOA可以改善临床治疗结局。

3 AOA治疗的研究进展

目前临床上常用的AOA方法包括电刺激激活法、机械激活法和化学激活法。电刺激激活法主要原理是通过电脉冲作用于卵母细胞质膜上使其形成小孔，促进Ca2+内流从而激活卵母细胞[15]。机械激活法则通过在显微镜下反复抽吸胞浆等机械方式达到激活卵子的目的[16]。化学激活法主要通过钙离子载体等化学试剂对ICSI受精卵子进行孵育处理，通过增加细胞膜的Ca2+通道通透性使胞外Ca2+内流激活卵母细胞，该方法也是目前临床应用最为广泛的激活方式。

钙离子载体A23187及离子霉素是目前AOA相关研究中使用最广泛的激活试剂，其可以诱发单次Ca2+水平波状升高，已被多项研究证实可以成功激活卵子。Darwish等[14]对既往有完全受精失败史和卵裂失败史的不孕症夫妇进行ICSI后，再使用钙离子载体A23187进行AOA治疗，发现受精率和卵裂率显著改善，并有活产胎儿出生。Borges等[17]对不同类型来源的精子进行ICSI后使用钙离子载体A23187进行AOA治疗，发现该方法可以显著增加手淫精子和附睾精子的受精率及胚胎发育结局。还有研究对比了行AOA治疗时钙离子载体A23187和离子霉素的激活效率，结果发现，在小鼠动物模型中离子霉素对卵母细胞的激活效率优于钙离子载体A23187，但在人体外成熟卵子中两种激活试剂的激活效率差异无统计学意义[18]。但值得注意的是，有研究认为钙离子载体A23187、离子霉素等只能诱发单次Ca2+水平升高，并不能模拟自然受精发生的多次钙振荡波，而SrCl2、PLCζ理论上可诱发多重钙振荡，更接近自然受精过程[19]。Vanden Meerschaut等[20]对小鼠卵子进行ICSI后，比较SrCl2、电脉冲和离子霉素的激活效率，结果发现SrCl2激活效果优于离子霉素。Fawzy等[21]比较了SrCl2和钙离子载体A23187在ICSI后受精率低或完全不受精的男性患者中的治疗效果，发现既往ICSI受精率低的患者使用SrCl2进行AOA治疗的临床结局更好，而前次完全受精失败的患者使用钙离子载体A23187治疗更有效。PLCζ作为精子特异性的卵子激活因子，也是一种理想的激活剂，Sanusi 等[22]研究证实重组人PLCζ可以有效激活小鼠卵子；而向ICSI后受精失败的人卵母细胞显微注射重组人PLCζ也可以激活卵子并进一步促进卵裂[23]。但由于目前重组人PLCζ生产纯化的技术尚不稳定，仍未大量生产，在临床中尚未得到应用。如何模拟自然受精状态的钙振荡波的辅助激活方法，从而提高AOA治疗效率是将来的研究方向。

4 AOA治疗的安全性

一直以来，关于AOA治疗的安全性始终是学者争论的焦点。虽然已有研究证实AOA可以显著改善受精结局，且已有活产胎儿分娩，但是化学激活剂对胚胎发育的潜在作用、非生理性卵子激活模式对胚胎基因表达以及对子代表观遗传的影响等，都是值得进一步研究的问题。

Vanden Meerschaut等[20]采用氯化锶分别结合电刺激和离子霉素激活小鼠经ICSI后的卵子，结果显示两种激活方法均可获得健康且有生育能力的小鼠，小鼠后代未见明显畸形。Miller等[24]对接受AOA治疗后出生的新生儿进行分析，未发现新生儿出生缺陷及发育异常。Vanden Meerschaut等[25]对经AOA治疗后出生的21名3～10岁儿童进行随访，发现这些儿童的神经发育和行为表现指标均与正常儿童无明显差异。但由于研究样本量有限，同时缺乏针对子代远期影响的研究结果，AOA治疗的安全性仍需进一步研究，且需要严格把握临床治疗指征和患者知情同意原则，确保AOA技术在临床应用的安全性。

5 结 语

ICSI受精失败后采用AOA治疗可以获得一定的临床效果，尤其对于ICSI完全受精失败或精子顶体形态异常患者，可以显著改善受精结局，提高临床治疗成功率。有关AOA技术的研究正在逐步开展，研发更贴近自然受精状态的激活模式是今后研究的趋势，我们在关注AOA技术带来临床获益的同时也应关注其安全性，探讨该技术对子代遗传改变及远期发育的影响，从而为AOA技术在临床上的应用提供科学依据。