流式细胞分选仪（BD FACSAria lll）分选中常见问题分析及处理

周羽 陈路 四川大学华西第二医院西部妇幼医学研究院疾病基因转录剪切调控实验室/出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室 （四川成都 610041）

内容提要： 流式细胞分选技术在基础科研和临床医学研究中的应用广泛。为提高分选操作效率，保障分选过程中故障能够及时处理，文章对BD（FACSAria III）流式细胞分选仪分选中常见问题分析和处理进行简单介绍。

流式细胞分选仪可以通过细胞大小、形态、颗粒复杂程度及细胞特异性标志物等多参数对细胞进行鉴别区分。流式细胞分选技术在临床和科研工作中应用范围涉及肿瘤学、血液学和免疫学等领域[1-4]。特别是在疾病诊断、疗效评估、微生物检测、物种倍性鉴定和金属纳米颗粒检测等生物医学研究及制药工业领域都有广泛的应用[5-10]。科研工作中样本分选前的准备通常还存在样本处理过程繁琐、样本需分批收集、分选前后样本需保持活性等特点。因此，仪器分选过程中对仪器操作员的分选经验有一定的要求。分选不顺利不仅延长整个实验周期，还会造成人力、物力和财力的浪费，因此，仪器日常维护和专业技术培训非常重要[11,12]。流式技术的发展关注精准性、易操作性、检测参数量、高纯度、高通量、灵敏度、流式数据展示以及数据分析等方面。新一代的流式细胞仪如量化成像分析流式细胞仪结合了荧光显微成像技术，可以将细胞信息进行量化成像分析，可用于药物筛选研究和外周血循环肿瘤细胞的检测[13-15]。本综述针对常用的流式细胞分选仪（BD FACSAria III）日常分选过程中经常遇到的问题进行详细的分析和整理。

1.流式细胞分选技术

1.1 流式分选技术优势

流式细胞仪可以根据不同的荧光信号对特异抗原、单个分子（DNA、RNA、蛋白）以及微生物进行特定分析和分选。流式细胞分选技术是最有效和快速的细胞分选技术。由于该技术对细胞分选具有高纯度、高活性以及高速的特点，因此流式分选技术在高纯度目的细胞、低含量细胞和多孔板分选中有显著优势。特别是BD FACSAria III在选择单细胞分选模式后可以很快地结合下游单细胞建库测序及其他实验。

1.2 流式分选原理

BD FACSAria Ⅲ型号流式分选仪具有卓越的多色性能，可以配置六根激光，具备18色的检测能力，能够满足多色交叉的复杂分选方案。同时该仪器自动化操作性强，具有较高分析灵敏度、分辨率和回收率等性能，在细胞分选中具有广泛的应用。分选进行时，样本中的细胞在压力的驱动下以液流形态通过石英杯流动池，激光聚焦到样本流上，细胞产生光学信号并被收集[16]。被圈定的目的细胞在电极板的加电作用下带上不同的电荷，分选仓可以给液滴充上正电荷或负电荷以及不同的电量，液滴的偏转角度被调节到合适的位置，因此包裹目的细胞的液滴可以实现多路分选，最多可以同时完成四路分选。在软件的分选调节窗口呈现的操作是调节电压的强弱就可以将包裹着细胞的液滴依次有序地分选到不同的收集管里。

1.3 影响流式分选的因素

流式分选过程涉及样本制备、样本保存、仪器校准质控、电压设置、补偿调节、圈门及数据分析等关键步骤[17]。①分选前，由于流式细胞分选的细胞纯度和效率与分选细胞样本的状态和染色、离心等操作有关。因此，分选前需要保持细胞的活性，选择合适的细胞缓冲液，并且避免过高离心转速对细胞造成损害。②分选中，分选细胞的纯度和得率与仪器的液流状态和分选模式选择有关，比如分选前后需要检查维护仪器液流系统、分选仓、收集仓等关键部件处于正常状态。因此，分选过程中样品、仪器和软件的实时监控显得尤为重要。分选过程中液流出现不稳定状态时，已调节好的液滴延迟时间可能不适用，液滴加电时间不准确，造成非目的细胞被分选到收集管中，从而间接影响了分选细胞的纯度。分选模式通常有三种：富集模式、纯化模式和单细胞模式。富集模式使所有含阳性细胞的液滴都被选中，而纯化模式是所有含阴性细胞的液滴都被舍弃。因此选择不同的分选模式会直接影响目的细胞的得率。此外，上样细胞的大小和浓度不同，分选过程中需要调节细胞的上样速率，保证细胞的分选效率。③分选后，由于实验目的不同，分选的细胞将用于培养或者裂解后提取核酸等。在对细胞活性要求较高的情况下，需要对分选过程中无菌环境进行严格把控，包括仪器无菌管路准备，分选操作人员取样、过滤、上样时进行无菌消毒处理，仪器上样仓和样品接收仓表面喷洒酒精消毒。如果分选后的细胞将用于提取RNA，细胞也需要保持较高的活性，否则细胞破碎会使释放出来的RNA被迅速降解。通常实验人员会在细胞缓冲液中加入防止RNA降解的成分，同时收集器连接冷凝管使样本保持4°C，并且收集到的细胞应及时进行后续实验处理。

2.分选中常见问题分析及处理（BD FACSAria lll）

2.1 液流紊乱

液流紊乱是流式细胞分选仪在分选过程中最常见的现象，操作人员需要及时发现和处理并首先关掉液流，否则会首先影响仪器的整个液流系统，造成样本的浪费，影响目的细胞的分选效果。液流突然紊乱的原因及解决方法通常有：①液流存在气泡：分选前如果鞘液过滤器中气泡没有排完，分选中液流就会受影响，需要重新彻底检查气泡是否排完；②液路出现漏液：检查液路管是不是漏液，拔掉重新扣紧，或者是管子里的密闭圈磨损了，磨损的话则更换密闭圈；③气路存在漏气：检查气管是不是没有扣紧或者鞘液桶的盖子周围漏气，可以用手感受一下，如果是密封圈磨损，则及时更换；④样本中有杂质或细胞粘黏严重堵住了流动室的喷嘴，因此超声清洗喷嘴，样本重新过滤处理后再上机。

2.2 上样速率

问题描述：设备运行过程中，上样速率突然变为0evt/s，但是液流窗口显示液流处于正常状态。可能原因：首先检查上样仓中流式样品管是否还有细胞悬液，排除细胞样本跑完造成的流速为零。该现象最常见的原因是样本中细胞成团对上样仓中进样针或喷嘴造成堵塞。处理方法：①细胞堵管道了，准备一管次氯酸，以最高速冲洗后，选择进样针反冲；②如果是进样针外壁细胞聚团，进样针反冲无法清洗干净，样本运行中就会出现堵塞，这时需要在拧旋钮处画个标记，拧开后取出进样针，打开进样针反冲，用吸水纸擦拭外壁，再按照之前标记的位置组装好后放回去；③如果是喷嘴堵了，将喷嘴超声处理。

2.3 分选速率

问题描述：仪器分选过程中分选速率变为0evt/s，但是样本流速正常。可能原因及处理方法有：①排除目的细胞所圈的门是开放式的门；②目的细胞所圈门的前面一个逻辑门位置避免处于信号过弱的位置；③目的细胞所在的门稍微移动下，有时可能是目的细胞比例极低，收集一定数量级目的细胞所需分选时间较久造成的软件识别反应滞后。

2.4 流式散点图形态改变

问题描述：样本运行时散点图中细胞信号点突然全部压线，紧贴坐标轴，而电压并没有改变过并且液流处于稳定状态。可能原因：通常是喷嘴的孔径进了气泡，但是又没有完全堵住喷嘴的孔径，因此还是会有液滴下落，细胞是挤着通过变窄的孔径的。处理方法：暂停液流，将喷嘴取下后重新安装，必要时超声处理喷嘴。

2.5 液滴延迟时间的调节

液滴延迟是指细胞经过激光检测区域到液滴分离断点之间的距离的时间。液滴延迟时间的确定关乎液滴最佳充电的时间，与最终细胞分选纯度和得率相关。因此液滴延迟的调节在流式分选过程中显得尤为重要。目前BD FACSAria III流式细胞仪有产品化的Accudrop微球，可以按照操作说明进行自动校准。但在实际过程中容易出现校准失败的情况，可能的原因及处理办法：①液流不稳。分选的液流需要达到最佳状态，也就是振幅和频率是比较稳定的状态，必要时需要重新调节。②Accudrop微球上样不符合要求。检查Accudrop微球是否在效期内并且最好是现配现用，确保微球的上样速率在合适的范围，通常速率要求是600～1500evts/s。

2.6 电极板加电错误

问题描述：流式仪分选仓中的电极板加电时会不断报错，提示加电发生错误，而仪器上电压指示灯呈现红色状态，这在分选中并不常见，但通常会发生在仪器开机时间过长，样本分选操作频繁的情况。电极板电压传感和软件连接失灵，电极板无法加电也不能关掉，重启软件或者机器也不能改善。原因分析及处理方法：可能放置仪器的房间里温度过高，影响分选仪电极板加电，可以调低空调设置温度，将仪器打开上盖和右侧盖进行降温后再开机进行分选。

2.7 四路分选

问题描述：流式细胞仪在四路分选过程中主液流分叉调节很重要。有时候会出现中心液流和左一路、左二路、右一路、右二路液流采集点几乎连成一条线的现象，该现象说明中心液流分叉很严重，而分选过程中主液流中细胞属于非目的细胞，分叉严重会导致非目的细胞通过左右两边的分液流被分选到流式收集管里。可能的原因及处理方法：①分选过程中液流突然出现不稳定的现象，干扰了电极板对液滴的加电。可以暂停分选，微调液流窗口中的amp，通常分选窗口液流的稳定性会有改善。②电极板表面有杂质，分选过程中液流溅到电极板表面，水分蒸发后留下PBS颗粒，也会干扰电极板对液滴的加电。可以用棉签擦拭电极板，液流分叉的情况会有改善。

3.小结

流式细胞分选仪（BD FACSAria III）属于大型精密仪器，仪器硬件故障率较低，而分选中经常会遇到一些高频率故障。光学系统方面，激光器每日启动后的稳定状态，可以通过仪器标准的质控流程检测，如有问题，需要及时调试；液流系统方面，液路紊乱或断流是发生频率较高的故障，需要实验人员做出及时处理；分选方面，液滴延迟和分选角度等在正式分选前调试好，在整个分选操作结束之前需要关注整个仪器运作的液路、光路、样本量剩余等稳定状态。待分选的细胞如果能够尽快顺利地进入分选流程，那么细胞是最大程度地保持了最佳状态，这有利于后续的实验。实验操作员熟练掌握流式分选技术可以保障细胞样本在最佳活性状态下完成分选。当流式细胞仪出现不稳定状态或者故障时，仪器操作员如果能够查找原因，做出正确的分析并及时处理，不仅能够保证样本的分选纯度，还能够避免仪器各贵重部件的进一步损坏，这有利于大型仪器的长期维护工作。同时避免了流式分选样本浪费的可能，尽可能地保证了样本中目的细胞的顺利分选。此外，实验人员可以参照包括血液学、免疫学等不同领域研究的流式操作指南，可以更详细了解样本分选前的样本处理、样本染色及分选中和分选后的注意事项。因此只有对流式分选原理和流程有清楚的认识，明确分选过程中导致分选中断的可能原因，才能排除故障并做出及时的处理，从而起到缩短分选时间，保证科研项目的顺利进行，为高校节约科研经费和为医院节省检验成本的作用。