生物打印工艺初探

2023-01-02谢能曹其新王金武

中国医疗器械信息 2022年11期

关键词：液滴凝胶生物

谢能曹其新王金武

1 上海市医疗器械化妆品审评核查中心（上海 200020）

2 上海交通大学（上海 200240）

3 上海交通大学医学院附属第九人民医院（上海 200011）

内容提要：针对目前生物打印中常用的工艺进行归纳总结，明确相应的关键工艺参数和要求，并对打印材料提出相应的要求，为后期生物打印医疗器械的质量控制摸索出一条道路。

增材制造技术作为数字化制造技术，已经逐渐渗入到多个生产、生活领域。其在医疗器械领域的应用也越来越广泛，生物打印在软骨、人造皮肤、人工血管上均取得了突破性的进展。生物打印为人类器官组织再生提供了一个全新的发展方向，被誉为未来30年的发展突破性领域。目前生物打印主要包括了凝胶与细胞的混合打印，其主要的问题是孔隙结构的联通关系，外部轮廓形状与边缘部分的孔隙率不足，精度不足，以及多喷头中材料和结构的梯度精度的控制问题。本文尝试针对目前常规使用的生物打印工艺加以总结和探讨，明确相应的打印工艺规范要求，为后期实际生物打印医疗器械产品的质量控制，摸索出一条路径。

1.生物打印的客观需求

目前，骨科植入物多为金属或者塑料类（聚醚醚酮）。这类材质可以作为假体植入人体，在物理性能上予以功能的恢复，但由于不具备血运功能，不可自我修复。植入患者需面对二次手术等相应的后期问题。生物打印技术内部多采用多孔结构，而多孔结构有利于细胞的迁移、分化及骨长入，生物打印植入物的孔隙率、联通性，包括多孔组织的降解速率均对后期的组织修复，患者康复效果均有至关重要的影响。所以生物打印在骨植入物方面具有广阔的应用前景。

而在器官移植领域，目前供体大量的缺失，不少肾脏、眼角膜疾病患者在等待合适供体的过程中，器官功能已走向衰竭。同时，部分接受了脏器移植的患者在手术后因需长期服用免疫抑制剂来抑制排异反应，导致身体抵抗力的大幅下降，最终造成脏器多种并发症。在可预见的将来，大量采用自体干细胞诱导生成的生物打印产品及器官将解决目前医疗领域中器官移植出现的诸多问题及不良反应。

金属、塑料类产品的无血运及此造成的手术二次翻修问题，以及供体移植类产品的缺失和对应的排异反应，均为生物打印技术的出现做了完美的铺垫。

2.生物打印工艺难点

细胞所处的整体环境，对于细胞的诱导分化是至关重要的。在长期的工程实践中，对于生物细胞的培养过去停留在二维水平，即通过培养皿进行指定细胞的培养。在二维培养环境中即使添加了诸多的细胞因子和诱导物质，仍无法有效模拟细胞在具体三维结构中产生的定向分化。如已知的成骨细胞，在骨中的不同位置均会出现不同的形态结构变化。而生物打印在细胞诱导分化上，首次提出制造一个三维仿真的模拟环境，通过提供细胞在三维结构下培养，利用不同的力学和微循环环境进行诱导分化，提供了重要的细胞演化基础。

目前使用的脊柱退化治疗中采用干细胞直接注入的方式存在运动代谢问题，导致细胞数量的不足，细胞生存微环境不理想导致细胞作用机制不畅，培养一段时间之后，细胞会启动凋亡机制，数量开始急剧减少。而三维环境下进行培养因为具有合理的细胞机制，营养输送渠道和力学、化学性能的反馈，可以持续地释放相应的细胞因子，保证了细胞的存活和增殖[1]。

在生物打印领域中还需要关注以下几方面的发展，以多细胞、多材料打印基于组织结构的类似植入体，才能更好地促进细胞诱导、分化，所以需要精准地控制细胞材料，进行组织结构打印，从物理、生物性能上与原有组织进行高度匹配匹配。针对性的工艺发展，目前生物打印工艺为通用型工艺，针对不同的临床要求及组织器官特点，应开展具有针对性的组织打印的工艺研究，以完美适配临床不断发展的需求。目前生物打印工艺的规范化尚存不足，应促进整个工艺的标准化、流程化、系列化、规范化，进而推动生物打印医疗器械在实际应用中的推广与应用。

3.常规生物打印工艺总结与探讨

3.1 挤出生物打印工艺

目前生物3D打印领域采用的工艺方法为挤出沉积成型法。该方法将所得的数字模型结构转变为多层结构，通过逐层打印所得结构层面，并在特定区域内打印相对应的活细胞。目前该方法多采用多喷头方式。

3.1.1 挤出生物打印系统主要构成

挤出生物打印系统分为运动控制、温度控制、供料控制、软件系统和无菌控制系统。

运动控制系统由XY平面运动机构和Z轴的升降机构组成。在打印开始阶段，将模型切片及代码转换成可操控的工作驱动命令。XY平面运动机构，根据实际的驱动指令，运动到指定的位置后，完成一层的运动轨迹扫描后，再按照规定的厚度下降至指定的位置。

温度控制系统包含三个主体，即：①材料储存温度控制系统。无论是水凝胶及细胞，其保存均有不同的温度要求，需要有不同的温度储存控制系统加以控制。②舱室温度控制系统，控制成型腔室的温度，来保证支撑凝胶的达到充分的支撑强度，细胞能在合适的成型温度中植入支架。③挤出系统的温度控制，包括喷嘴的温度的精确实时反馈及相应的控制。

挤出生物打印使用的供料挤出系统，考虑到使用凝胶的黏度和弹性的不同，以及细胞的保护作用，目前多采用气压加杠杆挤出的方式，通过丝杆的精度控制来控制挤出。

在挤出生物打印过程中，软件系统包括三维成型软件，切片软件及控制软件。三维成型软件将扫描的数据进行三维化处理，形成对应的三维数字模型。在模型基础上加以设计修改，完成支架系统的设计，形成合理的孔隙结构及支撑结构。随后一般以STL文件格式输出（STL格式是一种三角片化的数据文件格式）。STL数据模型导入切片软件，按照规定的层厚，将模型予以切片，切片数据导入下位控制软件中，形成可以运动控制的驱动命令并加以执行。

生物打印系统与其他增材制造工艺不同的一点是需要有实时的无菌控制系统。正常的金属塑料打印过程中均无无菌控制的要求，而由于生物打印系统中含有大量的活细胞，无法进行二次灭菌处理，故在打印过程中应进行无菌控制，以保证产品的无菌。如舱室系统的进出分系统均有高效过滤装置，保证内部循环系统的空气洁净度级别达到对应的无菌要求。在整个无菌舱室中应进行对应的气流测试，以保证在舱室内无气流死角，防止细菌的滋生和蔓延。同时由于供料系统软管内均接触到对应的活细胞及凝胶物料，均应进行对应的无菌化处理和控制，保证产品的无菌性能。

3.1.2 多喷头打印

在打印控制参数中有喷头规格大小，喷头内径的粗细选择，相对应的喷头的位置以及切片的参数，同时包括运动控制参数。如走丝的间距，每层的厚度，打印物料的挤出速度挤出速率等。

挤出生物打印通过构建模型号将凝胶液化，喷嘴温度设置为液化温度，逐点挤出在固定的位置上。然后通过低温舱室进行凝胶的固化。等上一层的凝胶固化后，再打印下一层的凝胶。

在实际打印过程中，由于生物组织材料的复杂性，不同区域需打印不同配比和种类的材料、细胞，所以在实际打印过程中，多需采用多喷头组合打印的方式，不同喷头对应不同的组织材料。

当设定程序中到达某一指定位置后，需切换到不同的打印组织时，打印喷头开关会自动关闭回位。另一个喷头经过XY方向的自动误差补偿，来到指定的位置继续后续打印，以形成生物组织的复杂梯度要求和精度控制要求。

3.1.3 工艺要求

通过前期多方的试验、验证研究，生物打印建立的三维空间结构和孔隙组织，对细胞的有着良好的诱导和保护作用，在打印过程中不同的工艺参数对产品的最终性能均有不同的影响。如喷头直径不同，造成的凝胶流速不同，进而导致对应的凝胶浓度、打印速度、打印丝距均有发生变化，故有必要对打印参数进行研讨和验证，以明确合理的打印工艺窗口。打印过程参数包括XY轴移动速度、层厚、挤出速度、丝间距、喷头温度、成型室温度、延迟时间、凝胶浓度等相应参数，明确对应的打印参数之间的相互作用关系，形成合理的工艺窗口。

3.1.3.1丝间距

水凝胶挤出到指定凝固层，从液态变成固态需要一定的固化时间。从喷嘴出来的丝横截面近乎于圆形。丝到达固定位置时，由于重力作用丝横截面形状会改变为近椭圆形。当丝间距设置过小时，从喷头挤出的丝会由于重力作用变形，相近的丝可能发生粘连造成孔隙的消失，影响后期营养物质的传递，最终导致细胞的凋亡。

丝间距设置过大时，由于从喷头挤出到固化需要相应的时间，造成丝的悬空部分过长，由于重力作用发生垮塌现象，造成断丝现象，并随着打印层数的不断增加垮塌处越来越明显，造成整个打印结构的失真，最终导致打印的失败。

3.1.3.2层高

层高设置对打印的影响巨大。当层高设置过小时，针头喷出的凝胶量过大，将针头淹没，在打印移动中把该层的凝胶刮破带跑。

当层高过大时，凝胶从喷嘴到指定位置需相应的时间，而在此过程中凝胶已固化，无法与下层凝胶组织产生良好的粘连作用，造成打印位置的偏移，结构的失真，最终造成打印的失败。

3.1.3.3填充结构

不同的填充结构对应不同的打印要求。对于偏重于结构精度的产品，多向重复扫描填充结构可防止因某个打印点断丝造成的结构塌陷产生的结构影响，保证产品的精度。对于偏重于力学性能的产品，双向扫描填充结构可使整个空间的力学性能趋于稳定，具有良好的支撑效果，便于营养物质的渗透。

3.1.3.4喷嘴温度

水凝胶在不同温度下的状态是不同的。当喷嘴温度过低时，水凝胶在喷嘴内已部分的凝胶化，形成颗粒状小颗粒，在挤出喷嘴时容易和喷嘴形成切割力。对凝胶造成剪切作用，使部分的物理性能下降，最终造成产品的物理性能不足，同时细胞也会在该过程中受到剪切力的损害。当温度过高时，喷嘴内挤出的凝胶为纯液体状，在降落到指定位置时，无法形成对应的丝状结构，而成为液体状散布在指定区域四周，造成打印的失败。

3.1.3.5材料浓度

水凝胶浓度与其具有的材料性能存在相互影响关系。浓度低时，凝胶成型差，需要凝成胶体的时间长。对应的舱室温度也需要更低，应选择合适的材料浓度，以达到最佳的凝胶时间。

3.1.3.6扫描速度

当扫描速度过快时，丝状凝胶尚未落到固定位置，而会发生偏移，形成结构的失真。同时过快的扫描速度，导致丝内部的张力过大，在成型后容易发生应力变形，导致结构变形和孔隙的消失。当扫描速度过慢时，丝状凝胶会发生堆积。堆积的部分凝胶会导致打印面的凹凸不平，使打印结构缺失，同时堆积的凝胶可能会和喷嘴发生接触，导致整个打印面的刮擦和破坏。

3.1.3.7打印舱室温度和无菌控制

打印舱室的温度与凝胶成型、细胞存活存在密切的关系。当舱室温度过高时，凝胶的成型速度降低，造成成型面无法按照预定时间固体化。部分区域仍为液体，接着下一层丝继续覆盖，形成垮塌造成整个打印面的破损，结构的缺失。打印舱室温度过低时，丝状凝胶会迅速地进行固体化。在打印过程中，凝胶离开喷嘴，迅速的凝固，造成丝材黏结力大幅度的下降。与下层的丝状体无法形成牢固的连接，造成整个打印面的偏离和缺失。同时，舱室应进行无菌化的处理，染菌环境会导致部分的舱室会导致整个产品的无菌状态失效，待产品植入人体后，导致炎症及其他的不良反应。

3.1.3.8打印路径的规划

由于丝材打印有一定的延迟性，从喷头降落到指定位置有延迟时间。当遇到拐弯点时，应设置有控制喷嘴关闭延迟时间，保证在拐点处没有过量的凝胶堆积。

3.2 同轴挤出工艺

目前在挤出生物打印工艺，利用表面张力及剪切力获取成型材料，但是无法获得微小直径的液滴。有研究团队，尝试采用共轴气流剪切方式获取微小液滴，从而实现快速制造细胞包裹的微小凝胶球[2]。通过气流剪切力，来克服凝胶与喷头间的表面张力。在同轴喷头中，喷头外侧喷射气流，内侧喷射含细胞的水凝胶，实现了快速可控的微结构生物打印。

在结构上该打印喷头与塑料软管相连，每种塑料管内有不同的材料。不同直径的金属毛细针管包含在喷头内部。金属毛细管上连接头与打印喷头相连接，保证不同材料的挤出。喷头与气压喷嘴相连通。

在实际打印过程中，喷头直径、气压对于成型尺寸有不同的要求。当气压过大时，喷头处的气体流量迅速提高，在喷头处产生的剪切力迅速增大，使液体形成液滴过小。气压过低时，液滴直径过大，多细胞液滴含量迅速上升。当喷头直径变小时，气体经过喷头的剪切力迅速增大，液滴直径变小，含单细胞的液滴数量迅速增大。

3.3 喷墨式生物打印

喷墨式生物打印主要分为热泡喷墨和压电喷墨打印方式。其中热泡喷墨是在喷嘴附近利用加热元件在腔体内产生蒸气泡，进而带动气泡，向下挤压，推出生物墨水。压电喷射生物打印主要是在喷嘴上方采用压电陶瓷片，以金属薄片复合。当通电产生信号驱动后，膜片开始上下振动，膜片下压带动液体受挤压。当压力超过液体表面张力的临界值时，液滴从喷嘴挤出。当膜片恢复形变液体腔内产生负压，吸取储液舱内的液体补充腔体。这种打印方式产生的打印颗粒直径微小，可用于生物传感器的打印。喷墨打印需要的生物墨水黏度较低，不利于在加工过程中控制细胞包被。同时为了达到在成型面上的迅速固化，保证结构精度，这类成型凝胶固化时间通常都极短，容易在打印过程中发生喷嘴堵塞，造成打印失败等情况。

3.4 激光辅助生物打印技术

激光辅助生物打印技术使用激光源，通过激光直接照射玻璃基质后的吸收层，吸收层对应位置受热后，使黏附在其上的生物墨水融化，喷射液滴到指定的位置[3]。该工艺打印速度快，激光不直接接触细胞，受损害程度小，但是工艺局限性大，通用性差需要针对特定结构设计。

激光辅助打印技术中，针对激光器有多种的激光参数需要进行验证，包括但不限于激光波长、激光能量、对应的生物墨水的黏度、金属吸收层的吸收系数等。当激光单位能量密度过小时，金属吸收层能量吸收过少，无法形成喷射液滴。激光能量密度过大时，生物墨水会在金属黏附层直接爆裂，无法形成射流。应进行验证，形成一个合理的工艺参数窗口。激光在加热金属吸收层时，会使金属吸收层产生蒸发，导致打印物中含有金属残留物[4]。

3.5 光固化打印

光固化打印是采用照射源，照射液面，形成投影面。使被照射的液体材料（一般为光敏树脂或光敏凝胶类物质，包含细胞）形成对应的固化层，逐层打印，最终形成样品[5]。该打印方式相对挤出速度上有明显的提高，但是光引发剂一般对细胞具有伤害作用，且光源直接照射到细胞表面，对细胞也具有一定的损伤作用。

在光固化打印中，应考虑打印的层厚、曝光强度等。

3.6 静电辅助打印

静电辅助生物打印是在金属喷头与底板间制造一个高压静电场，使含有细胞的凝胶获得电场力的作用，克服表面张力从而形成可调直径打印材料的生物打印技术。相比传统的技术及气压剪切挤出打印，由于电场力的可控可调，当电场力的拉力与液体表面张力达到了一个临界值，就会形成一个圆锥角，俗称为泰勒锥[6]。电场力进一步加大，随后液滴离开喷嘴，喷射到底板上。

由于静电场电压可调，意味着电场力可以调节大小，以获得更微小的喷射液滴直径。同时由于凝胶为导电物质，所以会在电场中形成电磁屏蔽，保证细胞不会受到电场力的作用，对细胞不造成静电场的伤害。应注意以下几点：①挤出气压。当电场强度较低时，液滴直径与挤出气压呈相关关系，气压越大液滴直径越小。当电场强度达到一定强度时，挤出气压对液滴造成的影响可以忽略。②电场强度。当电场强度上升时，液滴直径变小，当上升到临界值后，液滴的直径不再变化。③喷嘴直径。当针头喷嘴直径变小时，液滴也变小，但具有一定的临界值。

3.7 后处理

后处理主要采用了交联的方式[7]。生物打印部分的原料经过打印后，要进行相应的交联，主要包含物理交联和化学交联两种。物理交联通过疏水作用、离子作用来发生交联反应，最大限度免于化学污染。另一种是化学交联，通过化学反应来达到交联，保证物理结构性能的达标。

3.8 材料

3.8.1 天然类原材料

生物材料包括天然衍生聚合物凝胶、胶原、壳聚糖。

目前广泛用于生物打印的水凝胶溶液。水凝胶是作用于人体修复用的组织工程支架的基础支撑材料，为诱导细胞的分化提供三维的基础环境。水凝胶同时具有黏性和弹性，表现为蠕变等物理特性，在高温状态下变为液态，而在低温下凝固为固态。水凝胶内液相转变为固相的临界点，被称为凝胶点。在30 C时，水凝胶不溶于水，当温度逐步升高，凝胶开始逐步分解。一般来说凝胶随着温度不断升高，黏度也会相应地上升。

还有海藻酸钠溶液。海藻酸钠粉末提取于天然海藻中，是细胞壁和细胞间间质的组成部分，能接近于细胞外基质。粉末无色无味，在食品工业中应用广泛，具有性质稳定，价格低廉的优势。不同种类的天然海藻酸钠由于采摘季节不同在分子排列上具有不同，应保持海藻酸钠粉末批间差的一致性。

3.8.2 化学合成类

一类是化学合成材料，如聚乙二醇等[8]。生物打印中，存在单纯利用水凝胶（含细胞）进行的生物打印，在结构刚度、体内代谢降解速度上存在改进空间。目前已采用化学合成类材料加以改性，进而提高材料性能。

3.8.3 细胞

细胞是生物打印中重要的组成部分，主要为原代细胞和干细胞[9]。干细胞能够诱导、分化成多种功能性组织特异的细胞，而这些干细胞的诱导分化需要一个稳定的三维空间结构。有对应的力学反馈、化学信号刺激，进行诱导和分化[10]。由于打印主要使用自体干细胞来源，可以大大避免排异反应带来的免疫难题，是极有价值的应用方向。对于使用来自异体的胚胎干细胞存在较大的伦理争议及远期的免疫排斥风险，故不建议考虑。