宏基因组测序技术在感染性病原体检测中的应用进展

韩心远，高小娟 综述 熊丹，张秀明 审校

1.安徽理工大学医学院，安徽 淮南 232001；2.深圳市罗湖医院集团医学检验实验室，广东 深圳 518001

感染性疾病是全球十大死亡原因之一，多数感染由细菌、病毒、真菌和支原体等引起。其中以流感为代表的流行性病毒感染可在相对较短的时间内在人群中呈指数级传播[1]。然而目前超过50%的中枢神经系统感染者和40%~50%重症肺炎脓毒症患者无法得到确切的诊断[2-3]。此外，新发感染性疾病的不断出现以及临床上抗生素滥用、误用等问题都给临床病原诊断提出了更高的要求。宏基因组测序技术(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是对待测样本中的全部核酸成分进行“鸟枪法”大规模平行测序，再将测序数据进行生物信息学分析，以获取样本中完整的核酸序列信息的技术。现如今，该技术被越来越多地应用于临床，在感染性病原检测、病原生物学特征中展现了独特的技术优势和广阔的应用前景。本文将对宏基因组测序技术在感染性疾病病原体检测中的应用进行阐述，旨在进一步揭示宏基因组测序在感染性疾病诊治中的重要作用和应用价值。

1 宏基因组测序技术

宏基因组测序是一种直接从患者标本中进行泛核酸检测的方法，该方法可对样品中所有的核酸进行放大和并行测序，允许无差别检测所有微生物(如细菌、病毒、寄生虫和真菌)、抗体、毒力因子及宿主生物标志物等[4]。mNGS 技术的实验流程分为湿实验和干实验，其中湿实验包括核酸提取、文库构建、上机测序。干实验包括生信分析与报告解读，不同的临床样本在核酸提取之前需要进行不同的预处理，比如组织块的研磨、痰液液化、体液离心等以提高病原体检出率。文库构建是将基因组DNA片段化并在片段末端连接寡核苷酸接头的过程，文库质量直接影响测序数据质量。单样本的文库构建完成后通常需要进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，混合后进行上机测序。测序完成后，下机数据进入生信分析流程。该流程包括去除人源序列、处理微生物序列及相关元数据、检测候选目标微生物，实现检测与数据的转换[5]。最后，检验人员根据自动化系统产生的初步结果并结合相关临床指标、样本类型、病原体种类等因素进行综合分析进而完成报告的审核与发放。

mNGS在感染性疾病的诊断中相较于传统检测技术有诸多优势，如：(1)无需病原体培养，可直接对临床标本进行检测；(2)检测通量高，在一次检测中可获得标本中病原微生物的全部遗传信息；(3)敏感度高，丰度较低的微生物也可检出；(4)通过宏基因组测序可分析病原体多样性、种群结构、进化关系等，解读其与环境、宿主之间的相互联系。现mNGS已凭借其技术优势应用于包括呼吸系统感染、中枢神经系统感染及血液系统感染[6-9]等在内的多种感染性疾病的诊治中。目前绝大多数医院未建立宏基因组测序平台，而是借助第三方服务。从临床需求来看，医院自建平台和第三方提供检测服务都在发展。2020 年底我国相继出台了《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》[10]和《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》[11]，其中就mNGS的临床应用范围、样本采集、报告解读、诊断效能以及质量保证等方面进行了证据总结和意见推荐，以促进mNGS在感染性疾病领域的普及和规范化发展。

2 宏基因组测序在感染性疾病中的应用

2.1 细菌性感染 细菌性感染是临床上感染性疾病中最常见的类型之一，如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及肺炎链球菌感染等。目前通过传统的实验室诊断技术可培养鉴定的菌种有限，多重感染不易识别，致使疑难细菌感染患者难以得到及时有效的治疗。随着抗生素的广泛使用，临床细菌性感染的病原体构成越来越复杂。临床上通过细菌培养来鉴定细菌性感染存在一定的局限性：(1)细菌培养受限于标本中活菌的丰度，培养的时间普遍较长，阳性率普遍较低；(2)不同细菌的生长条件不同，部分细菌培养成功率低，甚至不能培养；(3)难以鉴定多重感染，易发生漏检。宏基因组测序在诊断细菌性感染方面可有效做到以下几点：(1)宏基因组测序有更高的阳性检出率。GENG 等[12]将63 例血培养阴性的危重症患者的血液进行mNGS 检测，比较其与传统检测方法的诊断效果，结果发现mNGS阳性率为41.3%，并诊断出16例混合感染，表明mNGS对血培养无法诊断的危重患者具有较好的适用性。在一项中枢系统感染的前瞻性队列研究报道中，研究者将230份脑脊液标本分别进行mNGS和常规培养。结果显示经验治疗组mNGS的检出率明显高于培养组(34.45%vs 7.56%)[7]。SUN等[13]证实mNGS 的敏感性明显高于其他常规结核试验的敏感性。且工作特征曲线分析显示mNGS 的曲线下面积(AUC)值最高，为0.79。(2)宏基因组测序技术可“无偏倚”地检测目标样本中几乎所有的核酸信息，以此来探究样本的菌群结构。DEI-CAS等[14]利用mNGS发现银屑病患者的肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门比例增加，这一比例会导致丁酸盐产量下降，低水平的丁酸盐可能影响黏膜层的完整性，损害肠道上皮。KRISHNA 等[15]用mNGS 分析结核病患者的痰液微生物群，门水平分析显示：结核病患者痰液中厚壁菌门和放线菌门的相对丰度显著高于健康对照；属水平分析显示：链球菌属，奈瑟菌属和韦荣氏球菌属是结核杆菌的优势属，表明痰液菌群的特征可能为肺结核的致病提供重要的见解。(3)细菌的药敏试验需要对病原菌进行分离，操作复杂且耗时，无法了解苛养菌的耐药信息。宏基因组测序技术既可以对病原微生物进行鉴定，也可以通过比对抗性基因数据库分析其耐药表型。有研究者通过mNGS 发现氨基酸取代GyrA S83F 和多个RNA 家族外排泵的表达是导致甲型副伤寒沙门菌对喹诺酮类药物以及头孢曲松耐药的原因[16]。SOMMER等[17]采用mNGS对2名健康人的唾液和粪便中的抗性基因进行研究，结果分离出290 个抗生素耐药基因，并筛选出13 种抗生素的表型抗性文库。凭借mNGS 对抗菌素耐药性机制的解析预测病原体耐药性，可方便临床医生为患者定制更优的治疗方案。由此可见，无论是在病原菌阳性检出率、多重感染的鉴定以及细菌耐药鉴定等方面，mNGS 相比于传统培养技术均表现出更佳的优势。

2.2 病毒性感染 病毒是临床上感染性疾病中常见的病原体之一。其种类多、变异快，传播途径多样可引起人体多部位感染。临床实验室对于病毒感染的检测，目前主要以免疫法、PCR等为主，但这些方法具有一定的局限性：(1)免疫法操作简单，价格便宜，但结果受限于已有的抗体种类，能够检测的病毒种类有限。(2)近年来已有多种多重PCR 的病原体检测方案，但所涉及的病原体种类也有限，因此一些少见或突变的病毒易被漏检。研究显示宏基因组测序技术无论是在病毒检出率、血清分型以及耐药性检测等方面都优于常规检测方法[18]。在病毒性感染检测方面，宏基因组测序可有效做到以下几点：(1)可有效检出未知及罕见的病原体类型。MAI 等[19]利用mNGS 首次在尿液中鉴定出日本脑炎病毒，表明尿液可作为检测日本脑炎病毒的一种有价值的诊断标本。HOFFMANN 等[20]通过mNGS 确定了一种新的斑纹松鼠博尔纳病毒(VSBV-1)为致命人类脑炎的来源。(2)可在没有病毒靶标富集的情况下诊断合并感染，从而更及时地在疫情爆发早期对可疑感染患者病情进行鉴别诊断以及对患者进行分类。MOSTAFA等[21]对50例感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)的 COVID-19 患者的鼻咽拭子进行mNGS 测序，结果检测出与肺部疾病恶化有关且丰度较高的流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌以及偏肺病毒，表明SARS-CoV-2 可以增加与肺炎有关的条件致病菌的感染能力。LI 等[22]使用mNGS 在 22 例埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)感染患者的血液样本中检测到15 例与出血热相关的恶性疟原虫的合并感染，其他合并感染包括乙型肝炎病毒、人类疱疹病毒4型等。表明mNGS可在EBOV爆发时期对病患感染情况分类提供有力的依据。(3)通过宏基因组测序鉴定病毒基因组可追踪病毒与感染性疾病之间的联系。于红美[23]对腹泻婴幼儿粪便样品中的病毒颗粒进行宏基因组测序、经数据质量筛选、聚类及组装后生成63 448 条序列，宏基因组分类显示与病毒相关的2 911条中有29条与轮状病毒有关。相对于传统病毒检测方法，mNGS不仅可解决其在病毒合并感染、罕见及新型病毒检测上的困难，也有效弥补其在追踪病毒来源问题上的不足。

2.3 其他感染 除了细菌、病毒外，mNGS 同样运用到其他种类的感染性病原体如真菌、支原体、衣原体、立克次体、寄生虫等[5，24-26]。ZHANG 等[27]报道了一例重症肺炎患者，通过核酸检测确诊为巨细胞病毒和甲型流感病毒感染，在接受抗病毒以及经验性抗真菌治疗后反应不佳，通过mNGS测序在患者支气管肺泡灌洗液中发现了三种真菌，分别是耶氏肺孢子菌、曲霉和米根霉。进而调整治疗方案，患者病情明显好转。YANG 等[28]利用 mNGS 和常规检测手段检测 106 例疑似肺部真菌感染患者的组织标本和肺泡灌洗液，比较二者在诊断肺部真菌感染的表现，结果显示mNGS的诊断敏感性显著高于常规检查(常规检查vs活检-mNGS：44.4% vs 80.0%；常规试验vs BALF-mNGS：44.4% vs 84.4%)。XIAO等[29]报道一例肾囊肿患者在术后出现感染反应，手术部位引流液和血液的细菌培养均显示阴性，术后17 d，mNGS的检测结果显示人型支原体感染，随即改变用药方案，患者痊愈。mNGS 可缩短鹦鹉热衣原体的诊断时间和病程，克服了鹦鹉热衣原体分离培养率低及血清学检测易受交叉反应干扰等问题[24]。宏基因组测序在寄生虫方面研究较少，未来的研究方向包括寄生虫的基因组特征以及寄生虫对肠道微生态环境的影响等[30]。

3 宏基因测序技术中的挑战

尽管已明确宏基因组测序技术在感染性疾病的病原体诊断中具有明显优势，但在实际检测工作中还存在一些技术与监管方面的问题。(1)高背景人源宿主核酸的干扰：mNGS 可检测临床样本中所有的核酸序列，宿主基因组信息在不同的临床检测样本中都有不同程度的占比，因此mNGS分析产生的巨大数据集中只有一部分可以用于病原体的鉴定，影响检测的灵敏度[31-33]。(2)样本、试剂以及实验环境的污染：在常用的DNA 提取试剂盒和其他实验室试剂中，外源DNA普遍存在，影响结果判读，特别是微生物载量低的样本。为了减少潜在的污染，现已有多种处理方式，如：γ或UV辐射、DNase处理、限制性酶切等[34-35]。(3)测序成本高。序列数据的产生方面成本已有很大降低，但是相比传统的检测方法，用于宏基因组测序的仪器和试剂价格均较高。(4)病原体基因组数据库不完善，有的生物信息数据库未能囊括所有病原微生物，有可能导致漏检[36]。目前常用的数据库有提供细菌、古菌以及真菌基因组的SILVA数据库和RDP数据库，提供病毒序列最全面的NCBI-NT 数据库等。实验室可结合患者临床特征选择合适的分析数据库以提高微生物鉴定的特异性和敏感性。(5)质量控制与评价的指南缺乏：mNGS 技术流程包含多个步骤，因此需要科学严谨的质量控制与评价方案来保证其质量的稳定从而满足临床需求。

随着高通量测序技术的不断进步，mNGS 对感染病原体的诊断方面越来越有重要的参考价值。综合以上关于mNGS 优劣所述，在以下几种情况推荐使用mNGS对感染性疾病进行诊断：(1)多次传统微生物检测查阴性，但又有明显感染症状的患者可使用mNGS进行检测，以克服部分病原菌难培养、罕见及新型病毒检测难的障碍。(2)针对多重感染情况，结合实际情况可优先考虑使用mNGS。(3)针对疑难重症，感染原因未知及诊断复杂的情况下，利用mNGS可全面解读病原微生物构成，分析患者主要病因。(4)临床医生如需了解病原体的丰度、多样性、功能结构及进化关系等以解读病原体与宿主和环境间的关系时，推荐使用mNGS。

4 小结

综上，相比传统的检测手段，mNGS有无可替代的优势，但mNGS 无法摆脱其技术本身的局限性，无法解决所有与病原体检测相关的问题。同时，这一行业发展仍处于发展初期，提供检测服务的第三方企业较多，应加紧制定规范化、系统化的标准，以利于市场整体的发展和临床诊疗的正确实施[37]。临床医生应抱着科学严谨的态度，以合理的方式将mNGS 应用于病原微生物的检测。未来，随着mNGS 相关质量标准确立、自动化程度逐渐提升、成本进一步降低，mNGS 的临床应用会更加成熟与广泛。在感染性疾病病原体的检测、细菌耐药基因的检测、病原微生物毒力基因的检测、菌株分型、微生物进化等方面会有更加突出的贡献。