ROS与脓毒症NLRP3活化的关系及其调控机制

韩雪妹 综述 王日兴 审校

海南医学院第二附属医院急诊科，海南 海口 570311

机体防御外来侵害的首要防线是固有免疫，炎性反应是最早的固有免疫反应之一，它能对抗进入人体引起疾病的外来微生物。大多数外来微生物在其细胞壁或细胞表面表达各种病原体相关分子模式(pathogen related molecular patterns，PAMP)，此外，机体在受刺激时，细胞可释放称为危险相关分子模式(danger related molecular patterns，DAMP)的危险信号，以识别紧急情况并通知免疫系统。PAMP和DAMP被固有免疫模式识别受体(pattern recogniition receptor，PRR)识别，从而引起一系列的免疫反应。炎症反应的发生不仅需要各种吞噬细胞通过PRR 识别PAMPs 和DAMPs，还需要细胞分泌多种促炎细胞因子，触发下游炎性反应途径，以消除微生物感染并修复受损的组织。然而，机体内过度的炎症反应可导致脓毒症，脓毒症为宿主对感染所引起的免疫反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[1]，早期由于缺乏治疗经验，脓毒症患者的病死率极高，在开展“拯救脓毒症运动”后，脓毒症的治疗方案也更为规范化，在加强抗感染、液体复苏、器官支持等综合治疗后[2]，脓毒症患者的病情得到好转，早期死亡率大大降低。不幸的是，尽管目前对脓毒症的理解及治疗有了极大地提高，但是与脓毒症相关的疾病的死亡率未能明显降低[3]。2020 年，一项关于我国重症医学科住院患者的研究表明，脓毒症的发病率为20.6%，病死率为35.5%，其中严重脓毒症病死率高达50%及以上[4]。虽然脓毒症患者病死率很高，但是目前尚无可针对性药物用于临床治疗。

炎性体是一种蛋白复合物，在机体免疫系统中起着重要作用[5]。炎性体的组成主要包括模式识别受体、凋亡相关斑点样蛋白和半胱氨酸蛋白酶1[6]。其中组成炎性体的模式识别受体最常见的是核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide binding oligomerization domain，NOD)，也称为 NOD 样受体(NOD like receotors，NLRs)。炎性体被激活后可促进各种炎性因子的释放，从而参与炎症反应。其中NLRP3炎性体与脓毒症发生、发展的关系最密切[7]，目前对其研究也最为深入。

1 NLRP3炎性体

NLRP3 炎性体是存在于胞质内的多种蛋白复合体，下面将分别介绍其组成蛋白。(1)核心蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样蛋白3(nucleotide-binding oligomerisation domain-like protein 3，NLRP3)：主要由三部分构成，包括氨基末端的嘧啶结构域(pyrimidine domain,PYD)、中心核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide bingding and oligomerization domain，NOD)和碳端富含亮氨酸的重复结构域(leucine rich repeat，LRR)。NLRP3 的嘧啶结构域与ASC 的嘧啶结构域相互作用，引发炎性体组装。正常情况下，NOD 结构域与LRR 结构域结合并处于抑制状态，当LRR 结构域识别各种刺激后(PAMPs 和DAMPs)可使NLRP3 发生寡聚化[8]。(2)连接蛋白含半胱氨酸蛋白酶募集结构域凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-like protein containing a caspase ectuitment domain，ASC)：主要由两部分组成，包括碳末端的半胱氨酸蛋白水解酶募集结构域(caspase activation and recruitment domain，CARD)氨基末端嘧啶结构域(PYD)。NLRP3 与ASC 的嘧啶结构域相互结合引发炎性体的组装后，ASC 与Caspase-1 的半胱氨酸蛋白水解酶募集结构域相互结合，至此，NLRP3 完成炎性体的组装，促进NLRP3 炎症小体的激活[9]。(3)效应蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶前体(cysteine aspartate specific protease-1 precursor，pro-caspase-1)：当NLRP3 炎性体完成组装后，效应蛋白pro-caspase-1 通过自身酶解作用形成具有生物活性的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteine aspartate specific protease-1，Caspase-1)，后者再将白介素 1β (interleukin 1β，IL-1β)和白介素 18 (interleukin 18，IL-18)的前体剪切成熟并分泌，促进炎症反应的发生、发展[10]。

2 NLRP3炎性体的启动及激活

迄今为止，研究已经证明了NLRP3炎性体可被多种多种物质激活，病原体包括：各种细菌、真菌、病毒；内源性物质包括ATP、ROS(reactive oxygen sepsis)；外源性刺激物包括石棉、尼古丁等[11]。这些结构上不同的分子触发NLRP3 寡聚化和炎性体激活的机制目前尚不清楚，但效果非常强烈。如果激活的NLRP3炎性体持续上调未被下调，则NLRP3炎性体将持续诱导炎症反应并导致多种疾病，包括脓毒症、阿尔茨海默病、与低温蛋白相关的周期性综合征、糖尿病和多种自身炎症性疾病等[12-13]。NLRP3炎性体的激活主要受双信号模型调控[14]。启动信号是由Toll样受体识别微生物成分或内源性细胞因子，激活核转录因子(nuclear transcription factor，NF-κB)，导致pro-IL-1β的表达增加以及NLRP3 mRNA表达上调并启动NLRP3炎性体。激活信号由各种PAMPs 和DAMPs 组成，使得核心蛋白NLRP3 活化，从而启动炎性体的组装，NLRP3 炎性体被激活。虽然目前对NLRP3 炎性体活化的具体调控机制研究仍不完全，但是目前较为认可的调控机制模型通常包括以下三种。(1)NLRP3炎性体活化的离子通道模型：K+外流、Na+内流是细胞内维持电解质平衡的常见现象，研究发现，胞内K+是NLRP3 炎性体激活的触发因素，细胞发挥作用所需要的ATP与细胞表面的P2X7 受体结合后[15]，可导致相关的离子通道开放，pannexin-1孔形成并允许K+从细胞内大量外流。胞质内钾离子的耗竭激活NLRP3炎性体后介导IL-1β的成熟和释放，此外K+外流还导致Ca2+非依赖性磷脂酶A2的激活，从而促进IL-1β成熟[16]。(2)NLRP3 炎性体活化的溶酶体破裂模型：各种PAMPs 和DAMPs 被细胞吞噬后，通过某些直接或间接的作用，将导致细胞内溶酶体破裂，组织蛋白酶B从胞质内释放出来，最近的研究表明，细胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)诱导组织蛋白酶B的激活，有助于NLRP3炎性体的激活，并加速Caspase-1 依赖性pro-IL-1β剪切成熟过程[17]。(3)NLRP3炎性体活化的活性氧模型：多种内源性与外源性的物质，如细菌、病毒和胞外的ATP等可介导NLRP3炎性体的活化，并且这些NLRP3炎性体激活剂均会触发ROS的产生，或协同ROS共同发挥活化作用[18-19]。所以目前的研究认为NLRP3激活的关键因素之一是ROS，ROS的生成减少及清除增多均会明显降低Caspase-1 活性，IL-1β分泌减少[20]。同时还发现线粒体自噬缺失的细胞，活性氧的产生也会增加，NLRP3 炎性体的活化也会增强[21]。下面将重点阐述NLRP3炎性体活化的活性氧模型。

3 活性氧介导的NLRP3炎症体的活化

众所周知，ROS是机体氧化还原反应的一种正常代谢产物，1961 年，Jensen 首先证明线粒体可产生ROS，而后随着研究的不断深入，才证实线粒体是ROS 的主要来源[22]。ROS 可以双向调节细胞的凋亡和增殖，并激活转录因子，以进行信号转导。但是，ROS 和线粒体在NLRP3 炎症小体激活中的作用仍有争议。ROS 被认为是NLRP3 炎性体激活的常见信号，因为大多数NLRP3 激动剂均会诱导ROS 的产生。已有的研究表明，NLRP3炎性体的配体之一硫氧还原蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)对ROS 敏感，其受体蛋白为氧化还原酶硫氧还原蛋白(thioredoxin，TRX)。在正常条件下，机体内的TXNIP 与TRX 结合形成复合物并处于静息状态。当炎症发生时，各种PAMPs 和DAMPs 刺激引起ROS浓度增加，复合物TXNIP-TRX解离，TXNIP与核心蛋白NLRP3 的LRR 结构域结合，可使NLRP3 发生寡聚化，激活NLRP3 炎性体[19]，促进炎症反应的发生。线粒体呼吸链中的NADPH氧化酶最初被认为是ROS产生的来源[23]。NADPH氧化酶4(NOX4)可调节肉碱棕榈酰转移酶1A (Carnitine palmitoyl transferase1A，CPT1A)并导致脂肪酸氧化增加，这有助于NLRP3 炎性体活化[24]。最近的一项研究表明，在创伤性脑损伤模型中，NADPH 氧化酶2(NOX2)的缺失降低了NLRP3 炎性体的表达，并扰乱了缺血性卒中后小鼠大脑皮层中NLRP3-TXNIP的相互作用，但这一现象并不出现于该模型的脐静脉内皮中，这表明ROS 在NLRP3炎性体激活中具有组织特异性作用[25]。然而，一些研究发现NLRP3炎性体活化在小鼠和人类细胞中都不受NADPH 氧化酶的遗传或药理学抑制的影响[26]。线粒体 ROS (mitochondria ROS，mtROS)在 NLRP3 炎性体激活中的作用最初是从一项研究中提出的，该研究表明通过线粒体呼吸链产生的mtROS 可以激活NLRP3 炎症小体[27]。同样，NAKAHIRA 等[28]发现，由功能失调的线粒体产生的mtROS 是NLRP3 炎性体激活所必需的，并且线粒体DNA(mitochondriaDNA，mtDNA)以NLRP3 和mtROS 依赖性方式释放到细胞质中。SHIMADA等[29]后来发现，虽然mtDNA与NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)相互作用，但氧化的mtDNA 才是NLRP3 炎性体激活所特别需要的。同样，ZHONG 等[30]的研究也指出，由各种刺激因素诱导合成的氧化型mtDNA是NLRP3炎性体激活所必需的。综上所述，这些研究表明在NLRP3 炎性体激活过程中，线粒体功能障碍、mtROS 和mtDNA起重要作用。然而，也有研究质疑mtROS和线粒体功能障碍在NLRP3 炎症小体激活中的作用[31-32]。值得注意的是，在这些研究中大多数都使用高浓度的化学抑制剂来抑制mtROS 的产生和线粒体功能，这很容易导致实验误差。并且至少有一项研究报告指出，ROS抑制剂还阻断了NLRP3炎性体激活的启动信号[31]。除了 mtROS 和 mtDNA 的产生外，NLRP3 炎性体可与线粒体的各种分子相互作用(包括线粒体抗病毒信号蛋白、线粒体融合蛋白2 和心磷脂)，促进其活化。例如MAVS 在病毒感染的情况下将核心蛋白NLRP3 募集到ASC，后者泛素化并促进NLRP3 寡聚化，促进了NLRP3 炎性体活化[33]。NLRP3 还被证明在病毒感染期间与线粒体线粒体融合蛋白2 直接相关[34]。心磷脂是线粒体内膜的一种脂质，直接与NLRP3 的LRR 结构域结合，若干扰心磷脂表达，不利于NLRP3 炎性体激活[35]。此外，线粒体自噬也参与NLRP3炎性体的活化，当线粒体自噬功能出现异常时，大量的线粒体活性氧累积，导致线粒体损伤，在没有其他炎性体激活剂的情况下活化NLRP3 炎性体[18-36]，这与线粒体功能紊乱有关，为活性氧的间接作用。线粒体活性氧作为NLRP3炎性体活化的关键因素之一，在脓毒症的调控中具有重要意义，针对线粒体活性氧活化NLRP3炎性体的调控机制进行研究，对各类感染性疾病，尤其是脓毒症的治疗提供治疗思路。

4 展望

炎症是机体对于刺激的一种防御反应，在有些情况下，炎症发生时产生的过量的炎症介质破坏机体的免疫功能，从而引起多器官功能障碍，即出现脓毒症，研究炎症反应的关键环节并进行拮抗是目前研究的方向。NLRP3 炎性体作为目前研究最为广泛的炎性体，对于机体的炎症调控至关重要。虽然目前对NLRP3炎性小体的激活调节机制并没有研究透彻，但是众多研究表明，NLRP3炎性体活化的关键因素之一是活性氧，而活性氧的主要来源是线粒体。线粒体通过产生ROS 或通过与NLRP3 炎性体的成分相互作用参与NLRP3 炎性体激活及下游的炎症级联反应。研究ROS 介导的脓毒症NLRP3 炎性体的激活、调控机制，为脓毒症治疗提供新理论、新方法、新的治疗靶点，有利于开发新的治疗性抗炎药。