ceRNA在缺血性脑卒中中的研究进展

王鹏宇 综述 杨锡彤，陈华秋，王光明，张元元 审校

1.大理大学临床医学院，云南 大理 671000；2.大理大学第一附属医院基因检测中心，云南 大理 671000；3.大理大学临床医学院内科教研室，云南 大理 671000

脑卒中是由脑血管突然破裂或者阻塞而造成的急性局灶性损伤引起的中枢神经系统功能缺损。卒中是全球范围内第二死亡原因，也是第三大致残原因。根据最新全球疾病负担研究显示，全球最高的卒中年龄标准化发病率在东亚地区[1]。卒中在我国是致死和致残的首位因素。最新《中国脑卒中防治报告2019》表明：我国卒中死亡人数高达190余万/年，其中发病逐渐年轻化，且发病类型绝大多数为缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)[2]。缺血在神经系统中往往会引起组织缺氧、细胞凋亡、炎症反应、氧化应激、自噬等一系列的病理生理过程[3]。随着社会老龄化加重及脑血管病风险因素的增加，我国卒中负担的增长呈现出爆发态势，因此我国卒中防治急需采取更有效的方法。目前许多研究发现竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)在IS 发挥着重要的作用。因此，从ceRNA角度研究IS致病机制具有重要意义。

1 ceRNA概述

ceRNA 假说在 2011 年的《Cell》杂志首次提出，PANDOLFI 等[4]发现信使RNA、假基因和长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)通过微小RNA应答元件(microRNA response elements，MREs)调控编码基因与非编码基因之间的“对话”来形成庞大的调控网络。ceRNA通过MREs发挥海绵吸附作用竞争结合或共享微小RNA(microRNA，miRNA)调控miRNA 下游靶基因的表达，是基因表达重要的转录后调节因子[5]。这种新型ceRNA调控网络的中心环节在于调节miRNA的表达实现调控miRNA靶基因的表达水平，其调控模型对于传统的miRNA调控机制更为精细和复杂，在很大程度上丰富人类基因组的功能。ceRNA 调控参与多种疾病的病理生理过程，其调控模式广泛存在于神经系统疾病，可为揭示IS发病的分子机制以及开展新的治疗方法提供基础。研究发现ceRNA 调控网络与缺血性脑卒中发病有着密切的关联[6]。目前在卒中研究ceRNA 分子最多的是lncRNA，其次为环状RNA(circular RNA，circRNA)。

2 LncRNA介导的ceRNA在缺血性脑卒中的发病机制

LncRNA 是一种由RNA 聚合酶在转录过程中产生的长单链非编码RNA，长度超过200 个核苷酸单位，在转录、转录后表达、表观遗传、结合miRNA、信号转导等多个层面进行基因表达的调控。LncRNA在中枢神经系统中具有高度特异性的表达，有效地调控中枢神经系统的发育和中枢神经疾病的进展。在IS 发生后，异常表达的lncRNA 参与了IS 发生后的神经细胞损伤及功能缺损的多个病理过程[7]。IS 后lncRNA表达的改变引起下游分子表达及功能发生转变，对卒中的疾病进展及预后形成有利或有害的影响。探索lncRNA 介导的ceRNA 在IS 后的分子机制，有助于全面了解IS的病理机制及损伤后的分子调控网络。

2.1 ceRNA 与氧化应激 氧化应激是氧化反应超过抗氧化反应的一种失衡状态，脑组织与其他器官相比最容易因活性氧(reactive oxygen species，ROS)增多而受到损伤，尤在IS后的损伤与ROS水平高度相关[8]。氧化应激反应中，另一关键分子超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是生物体内存在的一种抗氧化的金属酶，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。研究表明，IS 患者较健康人lncRNA Opa 相互作用蛋白5 反义转录本1 (OIP5 antisense RNA 1，OIP5-AS1)水平显著降低，miR-186-5p 水平显著增高。OIP5-AS1作为分子海绵作用于miR-186-5p调节C1q/TNF 相关蛋白 3 (C1q and TNF related 3，CTRP3)的表达。IS发生后下调的OIP5-AS1通过ceRNA网络间接使SOD、谷胱甘肽过氧化物酶的水平明显下降，从而导致IS 的氧化应激反应加重[9]。lncRNA 核仁小分子RNA宿主基因14(small nucleolar RNA host gene 14，SNHG14)在大脑中动脉闭塞小鼠模型中上调，SNHG14 利用分子海绵功能抑制miR-199b 表达使水通道蛋白4 (aquaporin 4，AQP4)表达水平上调，加剧IS的氧化反应。但当上调miR-199b 表达可以促进细胞的存活和提高SOD 的活性增强抗氧化作用，而过表达的AQP4 能消除上调miR-199b 水平所发挥的神经保护作用；因此，在脑卒中SNHG14 作为ceRNA 分子提高AQP4分子水平，加剧了氧化应激反应[10]。LncRNA 锌指结构反义转录本1 (ZNFX1 antisense RNA 1，ZFAS1)在IS患者表达减少，并负向调控miR-582-3p以致一氧化氮合酶3 表达下降，沉默一氧化氮合酶3基因使得SOD2 水平降低而ROS 水平增高，从而使氧化应激反应加重[11]。另有研究发现，LncRNA 横纹肌肉瘤相关转录物-2 (rhabdomyosarcoma 2 associated transcript，RMST)在IS患者血清表达增加，而miR-377表达减少，实验表明RMST作为ceRNA分子竞争结合miR-377 调控脑信号蛋白3A 的表达。当在神经细胞中敲除RMST后，通过上调miR-377 表达间接降低脑信号蛋白3A水平，可减轻缺血、缺氧引起的氧化应激反应对细胞的损伤[12]。综上所述，多个ceRNA分子参与调控IS 氧化应激反应中SOD、ROS 等关键分子的表达水平，进而对神经细胞或脑组织造成损伤。这些ceRNA 分子给揭示IS 病理过程的分子机制提供新思路。

2.2 ceRNA 与炎症反应 炎症反应是IS 病理生理过程和影响预后的主要因素，IS 因血流停滞、血管内白细胞活化及缺血的内皮细胞或脑实质细胞释放炎症因子等多种因素引起神经炎症反应[13]。炎症反应在IS是一把“双刃剑”：一是在急性期过度炎症反应造成二次机体损伤；另一方面炎性细胞原位分化为抗炎细胞，在慢性缺血期发挥清除细胞碎片、组织修复的功能。最新研究发现，lncRNA X染色体失活特异转录本(X-inactive specifc transcript，XIST)在IS实验中表达升高。在机制上XIST作为miR-362的ceRNA分子对其负性调控，从而解除对靶基因Rho 相关蛋白激酶2(Rho associated coiled-coil containing protein kinase 2，ROCK2)的抑制作用。实验敲除XIST后ROCK2 基因表达降低，使得白细胞介素6 (interleukin 6，IL-6)、白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等炎症因子水平显著下降，从而减轻炎症反应和神经损伤[14]。IL-1β、TNF的水平同样受SNHG14/miR-199b/AQP4 的ceRNA 调控轴调节。因此，在IS 发生后上调表达的SNHG14通过ceRNA 途径使炎症因子释放增加从而加重炎症反应[10]。炎症反应NF-κB 信号通路的研究显示IS 实验中lncRNA SNHG15表达上调，SNHG15海绵吸附miR-302a-3p 分子，从而使信号传导与转录激活因子1 (signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)表达增加，进而激活NF-κB信号通路。过表达的SNHG15显著增加IS后神经元细胞凋亡、炎症因子的释放和增强小胶质细胞氧化应激反应；当敲除SNHG15 或者上调miR-302a-3p可以减轻神经损伤和降低炎症因子水平，达到神经保护的作用[6]。另一研究表明，其通过SNHG8/miR-425-5p/沉默调节蛋白1(sirtuin 1，SIRT1)网络调控NF-κB通路。实验表明过表达的SNHG8可降低miR-425-5p的表达而提高SIRT1表达，进而抑制NF-κB信号通路活化，降低小胶质细胞的活化和内皮细胞的损伤，从而减轻IS后的炎症反应和血脑屏障的损伤[15]。IS发生后过度的炎症反应会加重甚至造成二次损伤，而在早期降低小胶质细胞的活化，减少炎症因子的释放，有助于减轻脑水肿及神经细胞的损伤[16]。以上研究表明，及早控制IS的炎症反应对疾病的进展及恢复具有一定价值。同时为进一步探究ceRNA 分子作为IS 的分子标志物或减轻炎症反应的治疗靶点带来新方向。

2.3 ceRNA 与细胞凋亡 细胞凋亡是维持机体内环境稳态的一种自主有序的细胞死亡。IS 后引起缺血组织Ca2+超载、产生大量ROS，以及兴奋毒性作用最终导致细胞凋亡[17]。细胞凋亡主要发生在缺血半暗区。随着时间延长，缺血半暗区的细胞凋亡发生增加，缺血中心范围进一步扩大从而造成神经功能缺损加重。研究表明新兴ceRNA 调控网络在IS 中细胞凋亡过程发挥着重要作用[18]。研究发现，IS 患者较健康人 lncRNA OIP5-AS1 水平显著降低，miR-186-5p 水平显著增高。在实验中OIP5-AS1作为分子海绵作用于 miR-186-5p 来调节 CTRP3 的表达，使 IS 后炎症因子增多、氧化应激反应加重，从而加速神经元细胞的凋亡[9]。在实验中lncRNA SNHG6 的表达增高，SNHG6作为miR-181c-5p的ceRNA分子对其负性调节，而miR-181c-5p 对靶向的BCL-2 蛋白家族编码基因BCL2 样蛋白 11 (BCL2 like 11，BCL2L11)起抑制作用。实验中SNHG6 表达降低时，可以减少IS 的梗死面积并改善美国卫生院卒中量表评分，但当过表达BIM 则增强Caspase-3 的活力及促进细胞凋亡[19]。BCL2 样蛋白 13(BCL2 like 13，BCL2L13)基因在 IS 实验中表达上调，其通过lncRNA叉头框D3反义转录本1(FOXD3 antisense RNA 1，FOXD3-AS1)/miR-765/BCL2L13调控轴调控凋亡蛋白表达。FOXD3-AS1在IS中过表达，通过ceRNA网络上调凋亡蛋白水平从而加速神经元细胞凋亡[20]。细胞凋亡进程中最重要的终末剪切酶是Caspase-3。在IS 中lncRNA 肺腺癌转移相关转录因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)作为 miR-205-3p 靶向蛋白酪氨酸磷酸酶基因(protein tyrosine phosphatase gene，PTEN)的 ceRNA 分子，通过调控 Caspase-3 的活性控制神经细胞的凋亡。实验中MALAT1表达降低，经ceRNA 网络使得PTEN 基因低表达来降低Caspase-3 活性，从而减少IS 神经细胞凋亡[21]。有研究发现，在 IS 中 PTEN 基因也受 lncRNA H19/miR-19a-3p调控轴调控。IS 实验中经此调控轴使PTEN 基因高表达时，活化磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B 信号通路来加重IS 的损伤[18]。因此，PTEN基因在IS中通过ceRNA网络介导神经细胞凋亡的过程是复杂交错的，但降低PTEN基因表达可以改善IS 的损伤。综上，通过ceRNA分子调控凋亡蛋白水平或者Caspase-3活性可为IS的治疗带来新策略。

2.4 ceRNA与血管生成 血管生成可促进侧支循环的形成，有助于恢复IS 缺血区的血供，及早恢复血供可以减少脑缺血的梗死面积[22]。缺血性脑损伤后血管生成在临床实践发挥着重要的作用，其中血管内皮生长因子是促血管生成的关键分子。研究发现，MALAT1 在IS 患者血清及氧糖剥夺的脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell，BMEC)实验中均高表达。MALAT1 高表达通过抑制miR-205-5p的表达来提高血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)表达水平，促进BMEC 增殖及血管生成[23]，有助于IS中侧支循环的建立。VEGFA 基因表达也受母源性表达基因8 (maternally expressed 8，MEG8)/miR-130a-5p/VEGFA 的调控，经此ceRNA 网络使VEGFA 基因表达增加，促进血管生成并减轻脑缺血情况[24]。另有研究，lncRNA核旁斑装配转录本1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1)表达上调而 miR-377 表达降低，miR-377 具有抑制血管生成及VEGFA 基因表达的功能。在IS 后NEAT1作为ceRNA分子调控miR-377/VEGFA 轴，使VEGFA 表达增加发挥促血管生成作用[25]。缺氧诱导因子在缺氧环境中也是促血管生成的关键分子。研究表明，lncRNA SNHG1具有ceRNA分子功能并在IS中高表达且抑制miR-18a 的表达，间接激活缺氧诱导因 子 1 α (hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1α)/VEGF 信号通路，促进 BMEC 的存活[26]，对血管生成起到重要作用。VEGFA、HIF-1α基因的高表达，可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移及形成新生血管，以致恢复缺血区血供和提高缺血区神经细胞的存活。

2.5 ceRNA 与细胞自噬 自噬在真核细胞是一种高度保守的细胞内自我降解过程，其在溶酶体降解清除胞内错误折叠的蛋白质和功能失调的细胞器[27]。细胞自噬也是一种维持自身稳态的适应性分解代谢过程，但是过度自噬会加速细胞的死亡导致疾病进一步恶化。最新研究发现，lncRNA 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶ⅡD (CAMK2D-associated transcript 2，C2dat2) 负 性 调 控 miR-30d-5p 的 表 达 ，miR-30d-5p 靶向沉默DNA 损伤诱导转录子4 (DNA damage inducible transcript 4，DDIT4)。C2dat2 在 IS模型中高表达，经ceRNA 网络使DDIT4 基因表达升高来抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路磷酸化，从而促进神经元细胞的自噬和凋亡，导致神经细胞损伤[28]。LncRNA MEG3 在实验中上调表达，过表达MEG3 使得miR-378 低表达而上调生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2，GRB2) 的表达。GRB2的高表达抑制蛋白激酶B/mTOR信号通路的激活，促进细胞自噬，以致IS 后神经功能障碍[29]。自噬反应中，自噬相关基因7 (autophagy related 7，ATG7)是关键启动子，在自噬激活过程中起到重要作用。当在IS患者中lncRNA KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 opposite strand/antisense transcript 1，KCNQ1OT1)显著高表达。研究证实，过表达的KCNQ1OT1作为分子海绵使miR-200a 表达降低，从而调控转录因子FOXO3 的高表达。FOXO3 直接靶向ATG7 启动子区域正向调控ATG7表达，激活依赖ATG7的自噬过程导致IS 后的损伤[30]。之前研究表明，lncRNA MALAT1与自噬相关基因Beclin1 在神经元细胞中竞争结合miR-30a，抑制miR-30a的表达，进而上调Beclin1的表达。当下调MALAT1 可通过调节miR-30a 抑制依赖Beclin1的自噬反应，从而降低缺血性脑卒中神经元细胞的死亡率[31]。在IS后神经细胞的过度自噬，引起缺血半暗带的神经细胞死亡增加，加剧神经损伤和功能障碍。

3 circRNA介导的ceRNA在缺血性脑卒中中的作用

circRNA 是一种非编码RNA，其参与多种生物学过程。circRNA 是共价闭合的环状非编码RNA，因其不具有线性RNA分子的5'和3'末端结构从而有着较强的稳定性，其也具有海绵吸附miRNA 分子的作用[32]。circRNA 已被证明在中枢神经系统中高度表达，具有神经特异性，参与缺血性脑卒中的炎症反应、细胞凋亡、血脑屏障功能障碍等病理过程[33]。到目前为止，有研究发现circRNA 作为ceRNA 分子发挥多种生物学作用[34]。

神经干细胞可以分化为星形胶质细胞和神经元细胞，在IS的恢复过程中扮演着重要的角色。研究发现circRNA 三角形四肽重复域3 (tetratricopeptide repeat domain 3，TTC3)和 Toll 样受体 4(toll like receptor 4，TLR4)在 IS 模型中高表达，而 miR-372-3p 表达降低。机制上TTC3 作为miR-372-3p 的ceRNA 分子提高TLR4的表达引起IS患者神经损伤及抑制神经干细胞的分化[35]。研究表明circRNA PHC3 在氧糖剥夺BMEC 中显著上调，机制上 PHC3 作为 ceRNA 分子海绵吸附miR-455-5p 从而上调肿瘤坏死因子受体相关因子 3 (TNF receptor associated factor 3，TRAF3)的表达，促进氧糖剥夺的BMEC 的死亡[36]，此研究为IS 后保护血脑屏障功能提供基础。circRNA在调控细胞凋亡的过程中也发挥着重要的作用，circRNA 含HECT结构域的E3 泛素蛋白连接酶1 (HECT domain E3 ubiquitin protein ligase 1，HECTD1)在IS 中显著上调，其作为ceRNA 分子负性调控miR-133b 并解除miR-133b 对TRAF3 的抑制作用。当下调HECTD1时可通过抑制NF-κB 通路减轻神经细胞的凋亡，改善脑梗死面积和神经元的死亡，起到神经保护的作用[34]。综上，circRNA通过ceRNA网络在IS 多个病理过程发挥着重要作用，将有望成为IS 的诊断标志物。随着circRNA 分子及功能的不断挖掘，可能很大程度上完善IS 发病的分子机制。

4 展望

目前，大多数研究基于lncRNA-miRNA-mRNA调控网络阐述IS 后其参与的各种病理过程，也有报道circRNA-miRNA-mRNA 调控机制所发挥的作用，但假基因等ceRNA 分子在IS 的作用机制尚不明确。再者，已发现具有功能的ceRNA分子在IS患者中的丰度需要进一步验证，以望挖掘潜在的IS新型标志物。最终，在缺血性脑卒中ceRNA网络中存在着多条途径靶向共同靶基因的现象，仍需深入研究多个ceRNA分子对共同靶基因的影响。