泡菜发酵中微生物的研究

赵虎威，陈燕飞，燕平梅

(太原师范学院 生物系，太原 030619)

1 概述

泡菜常常作为其他食物的辅料来食用，以使其他食物更有食欲或更容易消化。现在泡菜已经成为全世界各国人们饮食的重要组成部分。泡菜发酵过程中原料或底物的多样性或工艺参数的不同，使发酵产品种类繁多，这种多样性也反映在微生物的多样性上，这些微生物是影响和推动泡菜发酵和工业化过程的主要因素和生物化学控制因素。泡菜微生物在泡菜发酵中被培养和发现，这些微生物对经过发酵的泡菜最终产品的影响及其味道、质地和气味都至关重要。研究泡菜的成果引起了人们的重视和兴趣，经常食用新鲜的泡菜可以有效促进人们大肠和胃的正常蠕动，从而有效防止了肥胖和便秘。泡菜可以有效帮助抵抗和抑制细菌，还可帮助人体预防恶性肿瘤的发生和癌细胞的形成，以及帮助调节和维持人体的正常生理和内分泌机能等。泡菜的发酵，由一些在蔬菜及其制品表面产生或附着的微生物来进行发酵和完成，参与各种用于泡菜及其制品发酵的微生物种类比较多，数量也较大，其中主要包括常见的乳酸菌、酵母菌、霉菌、肠杆菌、其他同科的各类中性细菌、假单胞双胞芽杆菌及其他同属的各类细菌等。对泡菜发酵过程起主要辅助作用的微生物是乳酸菌，而除乳酸菌之外的其他酵母菌、醋酸菌和霉菌等各种微生物则对泡菜发酵起到了各种辅助发酵的重要作用[1]。此外，某些泡菜在其整个发酵期间与其酵母中的菌类还通过酯化发酵加成反应合并生成乳酸乙醇以及其他芳香醇类[2]。目前，对来自世界各国的各种泡菜及其相关制品中各种乳酸菌及其他微生物菌种的化学发酵机理作用问题研究很多，据各国媒体报道，韩国的各类泡菜中仍存在各种发酵乳酸菌及其微生物高达30多种。而且近年来，世界各国和我国本土对于泡菜制品发酵中乳酸菌类微生物的发酵作用研究也愈发深入。

2 文献综述

2.1 泡菜的腌制

泡菜的制作源于我国， 制作的原料主要是各种新鲜的蔬菜，把它们一起放入低盐溶液中，经过与乳酸菌等多种常见微生物混合进行发酵从而加工产生的一种美味可口的食品。在我国、日本、德国和朝鲜等国的历史悠久，从古至今发酵泡菜都受到了许多家庭和消费者的青睐和喜爱。泡菜略带咸味和酸性，味道鲜嫩，可以增进食欲，帮助消化，并具有一定的医疗和保健益处。

容器、卤水和调味料是制作泡菜的3个关键因素。制备泡菜的容器应具有良好的耐热性、搪瓷性、吸水性，无裂纹、无沙眼和清脆的钢声音的泡菜坛。正确的原料选择是使用新鲜和季节性的泡菜品种来提高泡菜的营养价值，且需质地鲜嫩，肉厚、肉质硬健，无任何蚊虫叮咬、烂痕、斑点者为佳；泡菜盐水的正确配制对新鲜泡菜产品的质量也具有重要性的影响，一般可以选择使用含盐和矿物质较多的水来配制泡菜盐水， 制作卤水的食盐应选用品尝起来含有苦味较少、矿物质含量也极少等品质良好的。泡菜卤水中食盐成分含量对其内的微生物数量和种类影响很大，而微生物的数量又与泡菜中的pH、酸度密切相关，所以食盐要适宜[3]。不同发酵原料和盐水中含盐量和pH值均会影响泡菜中酵母菌数量的多少[4]。料酒、蔗糖、高粱酒、葱、姜、蒜、辣椒、八角、草果、花椒、胡椒等调味料则是泡菜风味形成的关键，白酒和料酒使盐味更好地渗透进泡菜中，还可以杀死发酵过程中的某些有害菌；蔗糖和辣椒可以调和味道、增加鲜味以及防止泡菜变质；八角、花椒等可以起到增香、除去泡菜卤水中腥味的功效。周佳等研究表明泡菜的最适宜发酵条件为：卤水中食盐浓度为0.04，发酵温度为30 ℃，蔗糖浓度为0.03，乳酸菌、植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的最佳配比为3∶1∶1，该条件下得到的泡菜口感较佳[5]。

制作泡菜要先将蔬菜原料清洗干净放在一旁沥干水分，沥干后将其切成适宜大小，在其表面撒上一层薄薄的盐，然后将其放入泡菜坛中先腌制7～8 h，让盐分充分融入蔬菜中。接着将白酒、红糖、辣椒、八角、花椒、胡椒等调味料放入泡菜坛中，充分搅拌，使其和泡菜充分混合，再用泡菜坛盖盖上坛口，将凉水倒置其上,掺满坛沿即可，然后将其放在温度适宜的环境中发酵。熊涛等研究不同发酵温度对卤水的pH值、微生物数量和种类、有机糖、乳酸、乙酸和乙醇等含量的影响[6]。结果表明：卤水的温度会影响泡菜发酵中乳酸菌的生长繁殖。泡菜发酵环境的温度越高，越适宜乳酸菌的繁殖和代谢；当泡菜环境温度低时，适合酵母菌和大肠杆菌的存活和繁殖。所以，泡菜发酵的温度以15～25 ℃为宜。

2.2 泡菜微生物研究概况

2.2.1 国外泡菜微生物研究概况

泡菜一直以来都受到人们的关注，尤其是在“注重健康”的发达国家，其健康效益也在不断增加。蔬菜是营养物质的丰富来源，如维生素A、B、C、D等各类矿物质，益生菌纤维和生物活性植物化合物，包括酚酸、黄酮类、植物雌激素和生物活性肽。越来越多的科学研究表明，食用富含蔬菜的饮食与降低和年龄相关的风险之间存在着积极的关系。因此，越来越多的国外学者对研究泡菜发酵中的微生物与身体健康等方面越发感兴趣。Sebastian等[7]主要叙述了蔬菜和水果有一个微生物种群，该微生物区系中，主要由有益的微生物组成，包括酵母菌、毕希亚、念珠菌、托拉斯波真菌属(根霉)、有氧(芽孢杆菌和醋杆菌)和厌氧(乳酸菌)细菌，通常负责生蔬菜和水果的自然发酵，有助于它们的保存和稳定性。Carl等则综述了泡菜中的维生素含量，并对泡菜的细菌学变化进行了研究[8]，表明泡菜的发酵是由Leuconostoc、短乳杆菌和植物乳杆菌3种微生物生长和发酵的结果。

2.2.2 国内泡菜微生物研究概况

我国泡菜的微生物研究起源于20世纪30年代，典型成果有“乳酸菌主导发酵”，20世纪40年代则是采用传统方法鉴定并首次提出“乳杆菌属主导发酵”，这是我国老一辈科学家在泡菜微生物研究领域的重要发现。20世纪80年代和90年代，我国泡菜微生物研究进入了快速发展时期，结合国内外研究现状，我国的学者们首次提出了中国泡菜的三阶段式发酵，这也说明了泡菜发酵的动态变化。这一时期，大量的专家和学者采用可培养乳酸菌等微生物的手段深入研究了我国泡菜中的微生物，大大地丰富了我们对中国泡菜中微生物品种和菌群的了解和认识。

进入21世纪，随着我国分子泡菜微生物学研究技术的快速进步和发展，采用了一种将传统泡菜分离乳酸菌的纯化与现代分子泡菜微生物学鉴定(如16S rDNA)的方法使有机结合的技术手段被广泛应用于对泡菜乳酸菌微生物的科学研究中，2005年以后逐渐出现了PCR-DGGE、克隆文库等免培养方法研究泡菜微生物，过去一些难以培养的如嗜盐微生物、非乳酸菌细菌等大量被发现，进一步推动了泡菜微生物学的发展。而近年来宏基因组测序、定量PCR等手段的兴起也带动了泡菜微生物学研究的深入开展。尤其是四川在泡菜研究方面，在传统微生物学方法的基础上，应用现代分子微生物技术系统开展了四川省内各个不同地区的泡菜微生物菌群结构及变化的研究，第一个确定了明串珠菌、乳杆菌和乳球菌这3个属17个种的乳酸菌是主要优势菌群，之后应用多重PCR、高通量测序等方法进一步确定了泡菜中的主要优势菌群，建成我国国内首个泡菜微生物菌种的资源库。

2.3 泡菜所含微生物的种类

2.3.1 乳酸菌对泡菜发酵的作用

乳酸菌几乎无法直接分解植物纤维素并且不能水解植物蛋白质，因此乳酸菌几乎不会在泡菜植物发酵的过程中直接破坏植物细胞的纤维组织。乳酸菌可以产生多种氨基酸、维生素和酶，从而提高和改善泡菜的营养价值。乳酸菌通过厌氧发酵产生乳酸、丙酸等，可以使泡菜中形成一些酸性细菌，使泡菜产品具有柔软的酸味，并且可以抑制泡菜发酵环境中某些腐败微生物和致病微生物的生长。同时，泡菜在发酵过程中自然产生的庚酮和壬酮的类乳酸菌素还可以帮助使蔬菜产品的口感更加清新。乳酸菌属的微生物还可以分解产生许多具有一定抗菌活性的化学物质，如乙醇、二乙酰基、过氧化氢等，可以有效防止泡菜变质，延长其保质期[9]。植物乳酸菌发酵可以丰富各种泡菜产品以满足市场需求并创造更多的经济效益。

乳酸菌是参与调节人体肠道微生态平衡的主要菌系，具有益生菌的潜力[10]，它们也使得泡菜具有医疗保健的作用。Cortés-Rodríguez Viridiana等研究发现，泡菜发酵主要是乳酸菌的作用，并已经显示益生菌的特点包括：胆固醇还原和胆固醇同化；抗氧化活性离体；抗肿瘤活性；免疫调节；抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性致病菌的生长发育[11]。这些从泡菜发酵中分离出来的乳酸菌的特性支持了食用这些乳酸菌可能有益于人类健康的观点。

2.3.2 酵母菌对泡菜发酵的作用

酵母菌能产生少量气体，能产生有机醇，不产有机酸，利用还原糖的能力强，能产生脂类物质，更能适应高酸和高盐环境；酵母菌与其他植物乳杆菌共同进行发酵时会产生更多的酸[12-13]。酵母菌与乳酸菌共同混合发酵不仅要远远优于其他菌与乳酸菌共同发酵时的各项理化性能指标和感官味觉性能，而且发酵形成的泡菜成品还具有更好的泡菜风味和特殊口感[14]。酵母菌还具有一定的对DPPH酶等自由基酶的清除培养能力以及抗体细胞自动化的聚集培养能力。酵母菌可以促进植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和肠膜明串珠菌这3种乳酸菌的生长繁殖[15]。

2.3.3 醋酸菌对泡菜发酵的作用

因为泡菜发酵过程中用到了醋这类调味品，所以泡菜中会存在一定量的醋酸菌。醋酸菌是一种原核生物，在自然界中分布广泛，属于异养需氧型微生物，在泡菜发酵过程中需要氧气。醋酸杆菌在泡菜的整个发酵过程中能将其中形成的少量乙醇氧化成醋酸，然后将生成的醋酸和少量乳酸氧化成少量二氧化碳和水，并且醋酸菌还具有较高的抗乙酸能力[16]。醋酸菌在泡菜发酵过程中主要起到在泡菜发酵中辅助乳酸菌共同完成发酵泡菜的作用。因为有些菌株能够合成纤维素组成细胞壁外的基质，而细菌则埋置于纤维素微丝缠结的片层中。

2.3.4 霉菌对泡菜发酵的作用

霉菌属于真菌，生长和繁殖速度较快，菌落呈绒毛或蜘蛛网状。发酵产品中常用的霉菌主要是曲霉菌、毛霉菌和青霉菌。霉菌在泡菜发酵过程中主要将蔬菜等原料转化为其他物质，如有机糖、淀粉、纤维素、蛋白质等。在泡菜发酵的起始时间，霉菌起着重要的作用。但是，霉菌还会污染泡菜产品，并使其变质，甚至致畸、致癌和致突变。在泡菜发酵的后期，霉菌会分解原料中的蛋白质，严重影响泡菜的味道，还为其他有害微生物的生长繁殖提供了适宜的条件[17]。

2.4 微生物的研究方法

2.4.1 传统的鉴定方法

通过对泡菜中的微生物进行分离、纯化、培养一系列操作，对其在特定培养基上所表现出来的特性进行研究以鉴定微生物种类，这些特征包括形状、大小、正反面颜色、边缘形状、隆起、黏稠度、透明度、气味等。

除上述物理特征外，还可采用生理生化反应来对其进行研究，如对碳源、氮源等能源的需求，对生长因子的要求，其代谢产物的类型，进行染色反应所表现出来的特征以及研究微生物生长的温度范围，最适、最低和最高生长温度。

2.4.2 16S rRNA寡核苷酸的序列分析

细菌中包括3种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。5S rRNA虽然易分析，但其中含有的基因核苷酸只有几十个bp长度，没有提供足够的具体遗传化学信息；23S rRNA含有的基因核苷酸的个数则太多，进行遗传分析时较困难。而16S rRNA序列基因中的核苷酸各个序列之间长度变化适宜，序列长度变化与基因进化距离相符合适应，对各类微生物细胞进行基因序列变化分析的研究结果更准确。所以，现在一般建议采用16S rRNA对微生物进行基因测序优化分析。

16S rRNA序列分析的具体步骤为：对原始序列数据进行预处理，包括条码序列解复用、质量滤波、去噪、嵌合体检测和数据归一化；然后进行微生物多样性分析：先进的数据分析和可视化。

2.4.3 变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)

变性梯度凝胶电泳被广泛地应用于微生物科学分子群体生态学学术研究的各个领域，目前已经逐步发展并成为专门研究各类微生物分子群落形态结构的主要分子形态生物学研究方法之一。DGGE系统是一种基于DNA材料片段的变性熔融分解梯度特性将其加热分离的凝胶电泳系统。DGGE是根据DNA片段在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开，现已广泛应用于多样性基因调查、亲缘之间关系活性鉴定、基因突变活性检测等领域。

2.4.4 高通量测序(high-throughput sequencing)

利用高通量序列测序分析技术可以一次对几十万到几百万条诸如DNA的分子序列进行细致序列分析测定。高通量测序技术的主要工作原理为：将测序目标中的DNA分子剪切为小块的片段；然后将DNA两个分子相互结合后放到一个固相分子表面；并对单片段DNA分子进行扩增；一次复制一个碱基，然后检测信号；最后运用高分辨率的分子成像排序系统。

应用高通量分子测序不仅为我们提供了丰富的分子遗传学类信息，而且可以使每次测序的测量费用和排序时间大大缩短。技术的发展和进步使得这一方法变得更加可靠，绝大多数的转录表达(包括那些表达量极少的转录本)都能够被精准地定量。随着序列读长的增加，454焦磷酸测序法的使用频率将大增，进一步增加在非模式物种中鉴定基因的概率。

2.4.5 荧光定量PCR

在实时PCR荧光反应系统中首先添加了一个荧光团，将其与反应模板中的DNA混合后，进行了由高温反应变性、低温复性到适温反应延伸的一系列反应过程，通过实时仪器检测温度不断变化时的实时荧光反应信号并利用实时荧光反应信号分析来快速完成对各个起始反应模板的定量分析。此检测技术的最大优点之处在于它可实时检测PCR的起始扩增，并在起始扩增的每个指数检测阶段内可定量检测起始扩增模板。

2.5 各种微生物的分离和鉴定研究结果

Xiong分析了泡菜发酵过程中乳酸菌群的变化；结果表明肠系膜乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和玉米乳杆菌等主导泡菜的发酵[18]。肠系膜乳杆菌在蔬菜腌制后立即出现在卤水中，发酵过程中依次出现其他乳酸菌。乳酸主要发生在发酵初期，后期消失；肠系膜乳杆菌直到第5天才消失；玉米乳杆菌在中期存在，在第5.5天消失。植物乳杆菌和干酪乳杆菌主导了发酵的最后阶段。

曾骏采用26S rDNA序列分析法鉴定从泡菜样品中分离到的具有不同菌落特点的酵母菌。燕平梅等采用稀释涂布的方法分离所研究泡菜中的微生物[19]。通过运用传统微生物研究技术和16S rRNA基因对其进行鉴定，结果表明东北泡菜中乳酸菌具有抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的作用。另外，他们采用PCR-DGGE技术分析了泡菜中乳酸菌的多样性[20]。

魏雯丽等利用宏基因组测序技术深入解析了抑制泡菜在乳酸菌发酵和培养过程中的活性微生物。结果表明Pediococcus，Lactobacillus，Starmerella，Weissella，Weisugiyamaella,Millerozyma是抑制泡菜在乳酸菌发酵和培养过程中的主要活性微生物菌属[21]。吕嘉枥等采用Illumina MiSeq高通量测序技术，分析研究了自然发酵泡菜的样品的真菌群落结构多样性[22]。泡菜中的绝对优势菌群均为Ascomycota(子囊菌门)。而李恒等对泡菜研究结果表明，在泡菜发酵过程中，Ascomycota占绝对优势，是泡菜中的主要真菌群类[23]。

裴乐乐等采用了构建16S rRNA基因文库、18S rRNA基因文库及23S rRNA的ARDRA分型方法进行分析，对4种以细菌为原料的不同四川泡菜样品的分型进行了研究[24]。研究结果充分揭示了我国四川省生产泡菜的主要微生物来源的多样性，反映了不同的原料制成四川省传统泡菜的主要微生物来源群落的结构及其之间存在的差异性，为进一步深入探究传统泡菜的主要发酵过程和机理、泡菜的风味影响因子的形成和机制以及我国传统泡菜微生物在发酵过程中的工业化生产过程提供了一定的科学理论和基础[25]。田伟等也采用了此研究方法来鉴别泡菜中所分离的乳酸菌类别[26]。

2.6 引起泡菜变质的腐败微生物

2.6.1 腐败微生物

在泡菜的发酵过程中，乳酸菌可以将发酵泡菜制作过程中原料中的某些营养物质迅速转化为大量的养生风味营养物质和其他营养物质，如天然乳酸、氨基酸、维生素等，乳酸菌本身对发酵泡菜的这些营养风味物质功能破坏较小[27]。泡菜腐败或者变质的原因是泡菜中有害微生物的严重污染。泡菜腐败变质主要由酵母菌、霉菌和芽孢菌等微生物造成，这些腐败微生物所引起的变质可以认为是泡菜汁液中的某种生物胺和其他微生物中的毒素等含量过高所导致。日常使用的泡菜食物中的某些蛋白质和糖分子在腐败菌和其他微生物的光合作用下可以发生快速水解，分解后成为其中游离的各种氨基酸，然后使其脱落氨基并释放出糖和氨。陈岑等近年研究发现苏云金杆菌、G.candidum、解芽霉头孢杆菌、C.xestobii等能够直接引起各种泡菜不同品种程度的腐败，是主要的腐败有害微生物[28]。在泡菜中大量存在的亚丁酸菌、丁酸菌和腐败菌能分解泡菜中的营养物质，使其产生刺激性恶臭味；大肠杆菌可以从泡菜中释放出硫化氢和吲哚，这些都可使泡菜产生恶臭味，引起各类泡菜的腐败和变质。

2.6.2 腐败微生物的抑制

对泡菜发酵过程中的环境，如pH值、温度、食盐浓度、调味料的多少等进行控制，可以有效抑制腐败微生物的生长繁殖。pH值在4.5以下可减少微生物对泡菜的影响，使泡菜不易腐败变质；泡菜存放环境的温度和光照也会影响腐败微生物的生存和繁殖，阴凉避光的环境不适宜有害微生物的生存，适宜泡菜的保存。泡菜中所含的盐分也对有害微生物有重要的影响，盐分较高时会抑制微生物的生长，但不仅影响腐败微生物也抑制了乳酸菌等的生长繁殖，而且影响泡菜的口感；当泡菜中所含盐分较少时不能起到抑制微生物的作用，所以食盐含量以4%为宜。姜、大蒜和鲜红辣椒等添加进泡菜中都会有效降低一些泡菜香气中的刺激性气味化学物质，增加了一些泡菜的辛辣香气并有效抑制了一些泡菜的腐败，大蒜和鲜红辣椒对多数酵母菌株具有较强的消化抑制杀菌作用，生姜则对少数有害菌株具有促进生长的作用，当其在泡菜中的浓度均值超过6%时会有效抑制有害微生物的正常生长。花椒对大多数酵母菌都具有促进生长的作用，对少数酵母菌也具有较明显的抗菌抑制生长作用[29]，多酚也具有与上述花椒类似的抑制效果。

3 结论

关于泡菜微生物的研究和发展也存在着许多需要我们进一步思考和改进的问题：(1)目前关于泡菜发酵研究较多的是单批次发酵，对于多批次连续发酵的研究报道不多。(2)传统自然发酵泡菜的菌群较多，对其风味品质影响较大，目前对泡菜中菌群结构多样性研究较多的是以细菌为主，而对其中的真菌群落结构研究较少。(3)现在国内外关于各类泡菜食用微生物的相关研究主要集中在关于泡菜中多功能益生菌的有效筛选和推广应用以及关于泡菜食物发酵利用过程中泡菜微生物的环境变化影响分析这两个方面[30]。(4)最近由于DNA测序技术的普及，在探索这种微生物多样性的研究中可以观察到从基于文化的技术向基于测序的技术的转变。虽然这些独立于文化的技术有其自身的优势，但对于新的与工业相关的菌株的选择和鉴定来说，获得物理分离物是必要的。(5)传统上，采用变性梯度凝胶电泳、DGGE技术或16S rRNA基因的Sanger测序对微生物进行鉴定。最近，全基因组测序(WGS)随着测序成本的降低而日益流行，与单个标记基因的测序相比，WGS获得了更多关于感兴趣菌株的信息。因此，要开发并使用更先进的计算分析，如利用WGS获得基因组信息。虽然基于WGS的识别方法比传统方法花费更高，并且需要大量的生物信息学专业知识，但是能够获得基因组序列草稿或完整的基因组序列有助于探索分离微生物的功能潜力。泡菜中的微生物具有更高的易于培养的潜力，这样可以更容易地操作和更深入地研究。