单细胞RNA测序技术在主动脉扩张性疾病中的应用

郑 凯，任华亮，张望德，李春民

(首都医科大学附属北京朝阳医院 血管外科，北京 100020)

主动脉扩张性疾病是主动脉的一种病理性扩张状态，主要包括主动脉真性动脉瘤、假性动脉瘤和主动脉夹层，其代表疾病为主动脉夹层(aortic dissection，AD)和腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)[1]。Stanford B型 AD年发病率约为 3/10万例，20%患者未入院即死亡，Stanford A型 AD的发病率和病死率则更高[2]。40岁以上高危人群AAA的患病率为0.33%，破裂性 AAA病死率高达50%～70%，加上未及时手术的破裂性AAA，其总死亡率可高达90%[3]。

目前，主动脉扩张性疾病的治疗方式主要包括手术和介入治疗，手术过程复杂、风险大，对患者创伤大且费用较高，并无有效的药物预防和治疗措施，以至于其发生、发展机制成为当前研究的热点问题。以往的研究基本都是反映疾病发展过程中某个时间点的静态特征，并未从根本上揭示主动脉扩张疾病的发病机制。随着新兴技术手段的突破与应用，特别是单细胞测序技术的出现，为鉴定癌变细胞及其发展过程[4]、绘制组织器官发育转录图谱[5]、加深对病原微生物活动过程的认知[6]提供了重要的研究途径和方法，同样也推动了对主动脉疾病发生发展机制更为全面而深刻的理解。

1 单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术概述

普通转录组(Bulk RNA)是生物组织样品在某个时间对应的所有mRNA转录情况，是样品或组织中所有细胞转录组表达量的平均值，即是这些细胞“整体”的表征。然而，由于细胞异质性，相同表型细胞的遗传信息也可能存在显著差异，很多低丰度的信息会在“整体”表征中丢失，并不能反映样品中所有细胞或者某一群细胞的状态，因此需要对单个细胞的或者某一群细胞的转录状态进行深入的研究。 单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术的出现解决了这一问题，通过细胞悬液制备、mRNA反转录、文库构建和高通量测序4个步骤，以高分辨率和准确性分析给定样本中的每个细胞的转录组，识别新的细胞状态和群体，来寻找同类细胞间的表型和功能差异。

目前常用的单细胞转录组平台有10xGenomics、BD Rhapsody、Fluidigm C1、Bio-Rad等，其中10xGenomics是目前最为常用的单细胞捕获平台，不仅能够一次性分离并标记500～10 000个单细胞，并在单细胞水平进行检测，发现新的细胞类型，还能基于大量的单细胞基因表达数据，提供细胞表达特征聚类、标志物筛选、亚群表达特征分析等，是一种高效的单细胞基因表达水平检测技术[7]。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术在心血管研究中的应用已较为广泛，除了识别罕见的细胞亚群外，还可以基于每个细胞的转录组进行细胞轨迹分析，这在阐明祖细胞或干细胞分化过程中的细胞状态转变方面有重要作用。此外，scRNA-seq能够描绘小鼠和人的重要组织的转录和表观遗传图谱，包括心脏和冠状动脉组织，利用这些数据集，可以评估常见心血管细胞类型的器官特异性或组织特异性，例如内皮细胞、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)和成纤维细胞等。

2 单细胞RNA测序(scRNA-seq)在主动脉疾病中的研究进展

主动脉的管壁由细胞和细胞外基质组成，在生理情况下，这些组分能提供合适的管壁顺应性和弹性强度，以适应血流动力学等外部环境的改变。然而，在疾病状态下，各组分的失衡会导致动脉壁扩张、弹性减弱，从而引起主动脉瘤、夹层或破裂。

2.1 内皮细胞

血管内皮细胞完整的结构和功能可防止胶原纤维的降解以及弹性纤维和血管平滑肌细胞的破坏，对预防主动脉扩张有重要作用[8]。不同器官和组织的内皮细胞存在异质性，可能包含多种内皮细胞亚群，但异质性内皮细胞的种类和分子特征尚未阐明，并且血管再生或周转的复杂性使得人们需要更好地了解内皮细胞亚群之间的相互作用，并确定控制这些过程的特定基因。单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术鉴别出3种内皮细胞亚群，证明了过渡过程中基因表达的显著变化，并验证了主动脉内皮的异质性以及先前提出的祖细胞与分化细胞之间的层次关系[9]。单细胞RNA测序(scRNA-seq)还识别出内皮细胞中动态调节的全套转录图谱，同样区分出小鼠主动脉中3种不同内皮细胞亚群，并发现不同亚群在细胞外基质产生、脂质处理和血管生成或淋巴功能方面的功能专门化[10]。

2.2 平滑肌细胞

血管平滑肌细胞(VSMCs)是主动脉中膜内的主要细胞成分，在维持主动脉收缩功能和稳态中具有重要作用。VSMCs具有调节自身表型的特性，目前有大量研究聚焦于VSMCs表型转化的潜在分子机制。利用scRNA-seq技术分析弹性蛋白酶诱导的小鼠AAA样本，鉴定出4种SMC亚群，并发现在AAA进展过程中，3个主要的SMC亚群的比例减少，而占比较少的SMC亚群增加，并伴有SMC收缩标志物的下调和促炎基因的上调，该实验首次确定了AAA的主要血管细胞与动脉瘤相关的转录信号，这对于理解异质细胞在AAA中的作用具有重要意义[11]。利用scRNA-seq技术还发现了人升主动脉壁平滑肌细胞群体的异质性，鉴定出5种SMC相关亚群，包括收缩平滑肌细胞、应激平滑肌细胞，纤维肌细胞和两种增殖平滑肌细胞[12]，两实验鉴定出不同种类的平滑肌细胞，可能是上述两种模型在病理生理方面的内在差异的结果，其次可能与采用不同的数据分析和可视化的方法有关。以往小鼠动物实验发现TGF-β 和Klf4是平滑肌细胞调制的潜在驱动因素，对马凡综合征(Marfan syndrome,MFS)患者主动脉根部标本进行scRNAseq，证实了人类具有类似的SMC表型调节模式，这是首次报道的来自人类MFS患者主动脉瘤组织的scRNA-seq数据[13]，未来需要更多的人类MFS样本和非动脉瘤对照来确定主动脉瘤中最一致的调控基因。

2.3 免疫细胞

以往的研究证实，正常主动脉向病变状态转变的组织学环境以T、B淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞(Mφs)和肥大细胞等单核细胞浸润为特征，其中一种最突出、最主要的细胞是巨噬细胞[14]。

最新研究发现了3种主要巨噬细胞亚群，包括驻留型巨噬细胞群(resident-like macrophages，RES-like macrophages)、 高表达IL-1b的炎性巨噬群和新发现的高表达髓系触发受体2(Trem2)的巨噬细胞群(triggered receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2hi)。主动脉TREM2hi是首次发现的一种巨噬细胞亚群，其不仅在脂质处理和分解代谢过程中具有高度专门化的功能特征，而且参与破骨细胞的形成和破骨细胞功能执行过程，预示着该细胞群可能在动脉粥样硬化钙化过程中起着特殊的作用[15]。

动脉粥样硬化是在高脂血症的背景下发展起来的一种慢性炎性反应，先前已经证明积极降脂可以促进斑块的消退，且以巨噬细胞减少为特征。炎性反应过程的动态本质和Ly6chi单核细胞在斑块中的作用有关，这些细胞以前只被认为对斑块和炎性反应进展起作用，但现在却显示出抑制炎性反应的相反作用，未来可能是促进斑块消退的一种潜在方法[16]。

研究表明泡沫巨噬细胞比内膜非泡沫巨噬细胞表达更少的炎性反应相关基因，而高表达与脂质代谢和运输途径相关的基因，包括胆固醇代谢和PPAR信号通路基因。相反，内膜非泡沫巨噬细胞富含参与炎性反应过程的基因，包括细胞因子-细胞因子相互作用受体、NF-κB、IL-17、TLR和TNF-α[17]。

利用scRNA-seq技术发现AAA中含有血源性单核细胞亚群(Mo/MU-2)、单核细胞来源的修复性巨噬细胞亚群(Mo/MU-3)、单核细胞源性炎性巨噬细胞(Mo/MU-4)和2种不同的主动脉驻留巨噬细胞(AR-Mac)亚群(Mo/MU-1和Mo/MU-5)，这5种亚群表现出促炎基因和抗炎基因的双重表达[18]。通过对11例研究对象的升主动脉组织进行了scRNA-seq分析之后也分辨出5种巨噬细胞亚群，即M1-like1、M1-like2、M1-like3、M2-like1和M2-like2，因此，来自体外研究的传统M1和M2二分法在阐述体内活化巨噬细胞动态程序的分子基础方面是不够的[12]。

流式细胞测量术不能完全阐明实际细胞亚群的复杂性，尽管特殊的白细胞亚群表达相同的主要谱系标记，但其在功能上可能是不同的。有研究应用scRNA-seq和质谱流式细胞测量技术(mass cytometry)，检测到3个主要的B细胞亚群，阐释了不同亚群在疾病中存在差异调节，并发现了预测人类的心血管事件可能性[19]。

T淋巴细胞是升主动脉组织中发现的最大细胞群，活化的CD4 T淋巴细胞(CD4-Active)、静息CD4 T、调节性CD4 T淋巴细胞(CD4-Treg)表达不同的标记基因。研究发现动脉粥样硬化促进Treg细胞的可塑性，造成功能失调的干扰素IFNγ+Th1/Tregs的积聚，从而可能导致进一步的动脉炎性反应和动脉粥样硬化[20]。

2.4 细胞外基质

血管壁细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是主动脉壁内的主要非细胞成分，在维持主动脉壁的结构、弹性和应力中具有重要作用。血管细胞外基质由胶原、弹性蛋白和其他细胞外基质成分组成，如糖蛋白、无定形或可溶性蛋白多糖、生长因子和隔离在基质中的蛋白酶。细胞外基质的组分随血管壁膜(内膜、中膜和外膜)以及整个血管树的不同而存在差异[21]。在正常血管组织中，蛋白多糖的丰度很低，但在胸主动脉瘤和主动脉夹层组织的退行性主动脉中经常检测到蛋白多糖的异常积聚[22]。有研究报告：通过病变主动脉的scRNA-seq，确定netrin-1是AAA中介导炎性反应和慢性细胞外基质侵蚀之间的主要信号，巨噬细胞中netrin-1的靶向缺失可以保护小鼠免受AAA的侵袭[23]。

2.5 分子调控及信号通路

在AAA的形成与进展中，存在多种细胞因子的调控机制及信号通路。先前的研究表明AKT/mTOR信号通路在内皮细胞分化血管生成以及调节细胞新陈代谢中起关键作用[24]。血管干细胞/祖细胞在细胞分化过程中经历代谢重编程，AKT/mTOR依赖的糖酵解是内皮基因表达的关键，这些发现证明了c-Kit系细胞在主动脉内皮细胞更新和替换中的关键作用，并可能为血管疾病的治疗策略提供见解[25]。

Lck/yes新型酪氨酸激酶(Lck/yes novel tyrosine kinase,LYN)是酪氨酸激酶Src家族(Src family of tyrosine kinases,SFK) 的成员，除T细胞和一些天然淋巴样细胞外，在整个造血系统以及非造血细胞中均有表达。研究发现Lyn在调节特定的单核细胞亚群稳态中的作用，证实LYN是控制单核细胞数量和寿命的信号通路的关键调节因子，也是炎性疾病的潜在治疗靶点[26]。

3 问题与展望

单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术对细胞生物学的发展起到了积极的推动作用，该技术鉴定了主动脉壁的细胞亚群、揭示罕见细胞类型、全面描述细胞表型和基因型，为主动脉疾病的发生发展机制提供了更深入的理解。但目前研究多为动物实验，人体标本较难获取，且本身还存在对细胞存活率要求高、测序成本昂贵、缺少强大可靠的数据分析工具等限制，期待该技术未来能不断成熟和完善，提升血管外科医生对主动脉疾病等血管外科疾病的认识，从而实现该领域的精准治疗。