市售酸奶中发酵剂乳酸菌的耐药性及耐药基因研究进展

王炜哲，翟征远，郝彦玲

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

0 引 言

抗生素使用导致的微生物耐药已成为世界范围内医疗健康、食品安全和经济发展的最大威胁之一。用于人类及畜牧行业疾病治疗的抗生素主要包括大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、β-内酰胺类和磺胺类等抗生素[1]。抗生素使用调查结果显示，医药、农业和养殖等行业均存在着抗生素滥用现象，30%～50%的临床病例中存在抗生素施用过量[2]；兽用抗生素仅有小部分被动物吸收代谢，30%～90%的抗生素最终随动物排泄物排到环境中[3]，给临床治疗和环境中的细菌带来选择压力，导致耐药细菌的种类和数量不断增加。国家农业农村部194号公告规定,2020年7月起企业停止生产含有除中药外的促生长类药物的商品饲料，中国饲料进入了无抗时代[4]。

近年来，由于观察到抗生素耐药基因在有益细菌和致病菌之间的水平传播，人们对食源性乳酸菌及其抗生素抗性的重视程度不断增加[5]，耐药性研究也从临床相关菌株扩展到食源性乳酸菌。国际上规定用于酸奶发酵剂等食品工业菌株需具有无致病基因、无毒性代谢物、无抗生素耐药基因转移潜力等生物安全特性[6]。然而，在中国、土耳其、俄罗斯多个国家市售酸奶中分离出的发酵剂乳酸菌已鉴定到多种抗生素抗性，多重耐药率较高，同时部分菌株携带可转移耐药基因[7-9]。在乳制品生产加工过程中或人体肠道内，这些耐药基因存在着向益生菌或致病菌转移的潜在安全问题[10]。本文汇总了市售酸奶发酵剂乳酸菌耐药表型、基因型及耐药性转移研究，明确了加强发酵剂乳酸菌抗药性监测及耐药基因转移研究的重要意义[7]。

1 酸奶发酵剂乳酸菌耐药性检测方法及分布耐药表型

1.1 乳酸菌耐药性检测方法

药物敏感性实验是体外检测抗菌药物对微生物有无抑制作用的方法，是目前实验室及临床常用的细菌耐药性测定方法[11]，包括定性测定和定量测定。定性测定是通过测量固体培养基上抑菌圈的大小，判断受试菌株耐药情况，包括K-B纸片扩散法、打孔法、牛津杯法等[12]。定量测定包括稀释法和E-test法，稀释法通过测定乳酸菌在不同浓度药物培养基中的生长情况判断其最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度（MBC），依据培养基不同又可分为琼脂稀释法和肉汤稀释法[12]；E-test法，通过读取受试菌株抑菌圈与包被着指数梯度抗生素试纸条的交点处刻度，获取最低抑菌浓度[11]。

针对乳酸菌耐药实验结果的判读，美国临床实验室标准化协会（CLSI）提供了乳杆菌及乳球菌碳青霉烯类、大环内酯类、糖肽类等抗生素的耐药评判依据[13]。欧洲食品安全局（EFSA）提供了庆大霉素、链霉素和万古霉素等8种抗生素的判定标准[14]。另外，欧洲药敏试验委员会（EUCAST）提供了肠球菌耐药评判标准[15]。上述标准是目前乳酸菌耐药性评判的重要依据[14]。

1.2 酸奶发酵剂乳酸菌耐药表型

商业酸奶不同于自然发酵乳制品，其工业化生产中使用了商业发酵剂，为酸奶生产的品质控制提供保证。市售酸奶中除了应用最为广泛的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌，嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等也常被用作益生菌添加入酸奶发酵剂。然而近年来，多个国家出现市售发酵乳制品中分离出的乳酸菌对抗生素存在耐药性，发酵剂菌种的耐药检测及安全性评价成为研究热点。

1.2.1 对抑制蛋白质合成抗生素的耐药性分析

在抑制蛋白质合成的抗生素中，乳杆菌和嗜热链球菌对氨基糖苷类抗生素具有较高的耐药性，其中对卡那霉素和链霉素的耐药最为广泛[10,16,-17]。乳杆菌及嗜热链球菌对四环素和氯霉素表现出不同程度的耐受情况，于涛等[18]利用纸片扩散法鉴定到31株乳杆菌中的四环素耐药率为61.3%，25株嗜热链球菌中四环素耐药率为20.0%，而分离自北京市售酸奶的70株乳杆菌及30株嗜热链球菌均表现四环素敏感[17]；Yang等[19]利用微量肉汤稀释法鉴定到43株乳杆菌氯霉素耐药率为58.1%，39株嗜热链球菌氯霉素耐药率为71.8%，而分离自邯郸市售酸奶的48株乳杆菌氯霉素耐药率仅为2.08%，43株嗜热链球菌均表现为氯霉素敏感[19]。大部分乳杆菌和嗜热链球菌对大环内酯类类抗生素表现为敏感，分离自邯郸市售酸奶的48株乳杆菌分离株仅有2.08%对红霉素耐药，43株嗜热链球菌均表现为红霉素敏感[20]。

1.2.2 对抑制细胞壁合成的抗生素耐药性分析

在抑制细胞壁合成的抗生素中，几乎全部的干酪乳杆菌和植物乳杆菌表现为万古霉素耐药[20]，但大量的嗜酸乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种为万古霉素敏感菌株[19,22]。嗜热链球菌对万古霉素则表现出不同程度的耐受，Erginkaya等[8]对土耳其发酵乳制品中分离的乳酸菌进行耐药分析，发现40%嗜热链球菌为万古霉素耐药，而分离自广州市售酸奶的乳酸菌中，仅有8%嗜热链球菌为万古霉素耐药[10]。嗜热链球菌和乳杆菌对β-内酰胺类抗生素，如青霉素、氨苄青霉素和头孢呋定等敏感，例如，北京市售酸奶分离的37株乳杆菌和15株嗜热链球菌对青霉素和氨苄青霉素均敏感[22-23]。

1.2.3 对抑制核酸合成的抗生素耐药性分析

在抑制核酸合成的抗生素中，乳杆菌和嗜热链球菌对喹诺酮类抗生素具有一定的耐受性，如环丙沙星、萘啶酸和达氟沙星等，其中环丙沙星耐药比率最高。凡琴从17个品牌酸奶中分离的14株嗜热链球菌和21株乳杆菌均表现为萘啶酮酸、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星及多粘菌素E耐药[7]。石磊等利用E-test法和纸片扩散法检测发现分离自广州市售酸奶的23株乳杆菌也表现为100%的环丙沙星耐药率[10]。

1.2.4 对抑制叶酸合成的抗生素耐药性分析

在叶酸合成抑制类药物中，大部分乳杆菌对磺胺类抗生素表现为耐药，Xu等[24]利用微量肉汤稀释法对33株从酸奶分离的乳杆菌进行药敏实验，54.6%的菌株表现为磺胺甲恶唑耐药。嗜热链球菌对磺胺类抗生素显现不同程度的耐受性，25株酸奶及发酵剂分离的嗜热链球菌耐药分析发现22.27%的菌株表现为复方新诺明耐药[25]，而分离自绍兴市售酸奶的嗜热链球菌对复方新诺明全部表现为敏感[26]。

2 酸奶发酵剂乳酸菌耐药基因的携带情况

乳酸菌的耐药表型与其携带的耐药基因具有相关性，且携带耐药基因本身就会给乳酸菌的安全应用带来风险[12]。研究人员利用分子生物学方法，如耐药基因PCR扩增、DNA微阵列和全基因组测序等从市售酸奶分离乳酸菌中鉴定到多种耐药基因[27]。

2.1 糖肽类和喹诺酮类的耐药基因

万古霉素是糖肽类抗生素，能够与敏感菌株细胞壁前体五肽D-丙氨酰-D-丙氨酸以氢键连接，从而阻断肽聚糖的聚合，而在抗性菌株中D-丙氨酰-D-丙氨酸被D-丙氨酰-D-丝氨酸或D-丙氨酰-D-乳酸取代，导致万古霉素结合能力下降[28]。大多数乳杆菌具有编码D-丙氨酰-D-丝氨酸连接酶vanE基因[21]和D-丙氨酰-D-丙氨酸水解酶的vanX基因[28]。D-丙氨酰-D-丙氨酸水解酶VanX与D-乳酸脱氢酶、羧肽酶、D-丙氨酰-D-乳酸连接酶协同将细菌细胞壁五肽末端修饰为D-丙氨酰-D-乳酸[29]。

环丙沙星是喹酮类抗生素，通过抑制DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的功能，阻断DNA复制发挥抑菌功能[30]。Jiang等从酸奶分离的环丙沙星抗性乳杆菌中，编码DNA促旋酶和拓扑异构酶IV的基因gyrA和parC发生突变，导致抗生素与靶位点的结合能力下降，菌株表现为环丙沙星耐药[31]。

2.2 氨基糖苷类和四环素的耐药基因

庆大霉素、卡那霉素和链霉素是氨基糖苷类抗生素，通过与敏感菌株核糖体30S亚基A位点结合，干扰细菌蛋白质合成[32]。氨基糖苷类抗生素耐药基因以编码修饰酶为主，通过对抗生素的修饰，降低其与核糖体结合能力，从而产生耐药性。aph（3′）IIIa编码磷酸转移酶介导卡那霉素抗性[33]。aac(6′)-aph(2′′)编码双功能复合酶，既有6'乙酰转移酶，又有2'磷酸转移酶活性[34]，介导庆大霉素抗性[35]。ant(6)编码核苷转移酶在链霉素耐药中占主导地位，此外，酸奶发酵剂菌株中还发现了其他链霉素耐药基因，如氨基糖苷-3-磷酸转移酶基因strA、氨基糖苷-6-磷酸转移酶基因strB、氨基糖苷腺苷酸转移酶基因aadA和aadE[19,25,36]。

四环素类抗生素通过阻碍氨酰-tRNA与核糖体A位点的结合来抑制蛋白质合成[37]。四环素耐药基因种类繁多，包括编码核糖体保护蛋白的tetM、tetO、tetS、tetW和编码外排泵的tetK、tetL等抗性基因[17,19,22]，其中tetM、tetS、tetK和tetL是酸奶发酵剂乳酸菌中常见的四环素耐药基因。

2.3 大环内酯类和磺胺类抗生素的耐药基因

红霉素是大环内酯类抗生素，当红霉素与敏感菌株核糖体23S rRNA结合时，tRNA转位受到干扰，新生肽链的延伸被阻断[38]。市售酸奶中分离到的编码红霉素抗性的主要基因为ermB和mefA[36]。ermB编码rRNA甲基化酶，在乳酸菌红霉素耐药中占主导地位，该酶催化23S rRNA的2058位腺嘌呤核苷酸甲基化修饰，使红霉素与靶位点的结合能力下降[39]。mefA编码红霉素外排泵系统，通过将菌体内的红霉素排出体外，提高菌体对红霉素的抗性。

磺胺类药物，利用对氨基苯磺酸与氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，阻断细菌中二氢叶酸的生物合成[40]，其增效剂甲氧嘧啶可抑制二氢叶酸还原酶活性。酸奶发酵剂乳酸菌中鉴定到，突变的二氢叶酸合成酶基因sulI和sulII使抗生素与靶位点的结合能力降低，菌株表现为磺胺类抗生素耐药[18-19]。突变的二氢叶酸还原酶基因drfA和drfD能够介导一定水平的甲氧苄啶耐药性，在酸奶乳杆菌分离株中均有鉴定[21,41]。

此外，乳酸菌耐药研究中发现耐药表型与耐药基因型之间存在着不一致性。部分对某种抗生素敏感的乳酸菌也可能携带与其相关的耐药基因。秦宇轩等[17]用PCR特异性扩增结合测序的方法在红霉素和四环素敏感的乳酸菌中检测到相应的耐药基因，这种潜在的耐药基因无法与耐药表型相关联，更容易在安全性评价中被忽视，使食源性乳酸菌成为耐药基因的蓄水池。与之相反的是，部分耐药乳酸菌未鉴定到对应的耐药基因，研究人员对乳酸菌的耐药研究多借鉴临床致病菌的机制，而乳酸菌对某些抗生素的耐药机制可能与病原菌不同，使得其耐药基因未被探明，研究人员需进一步针对乳酸菌研究其耐药机制，为乳酸菌的安全性评价提供理论依据。

3 乳酸菌耐药性转移

微生物耐药性可以分为固有耐药和获得性耐药。固有耐药是指依靠自身基因组包含的耐药基因而具有对某类抗生素的抗性，其耐药性能够稳定遗传[42]。获得性耐药分为菌体基因自发突变[9]和通过转座子或质粒等移动元件[25]水平转移两种方式，其中水平转移是耐药基因获得的主要途径[43]。

氨基糖苷类抗生素是乳杆菌和嗜热链球菌固有耐药，万古霉素、喹诺酮类及磺胺类抗生素同样列入乳杆菌固有耐药，而四环素和红霉素耐药基因常与乳酸菌质粒及转座元件有关。具有固有耐药性的乳酸菌理论上是安全的，但是区分基因层面的固有性和获得性耐药非常困难，判断一株菌株对某种抗生素是否为固有耐药的最准确的方式是研究其耐药基因是否会发生传递，因此乳酸菌的耐药基因是否转移是研究者们评价乳酸菌安全性的重点内容，研究已发现一些乳酸菌的几种抗性基因可在乳酸菌与乳酸菌、乳酸菌与病原菌之间发生传递，所以完善针对商业菌种的耐药性安全评价已刻不容缓。

乳酸菌耐药基因转移性研究主要采用体外试验，滤膜结合法是常用的体外结合转移的方法。Yang等[19]利用滤膜接合法将四环素耐药基因tetM和tetS分别从德氏乳杆菌保加利亚亚种和植物乳杆菌转移到单增李斯特菌L82，转移率为7.3×10-7～2.9×10-6；Nawaz等[22]通过滤膜结合转移实验发现分离自发酵乳制品的发酵乳杆菌MWL24的ermB基因，能够转移至粪肠球菌181，转移率为2.62±0.81×10-5;植物乳杆菌MWL22的tetM基因，能够转移至粪肠球菌181，转移率为1.39±0.06×10-5。乳酸菌抗性基因体内的转移性研究目前较少，Feld等[45]检测到位于植物乳杆菌中质粒p LFE1上的ermB可在无菌小鼠体内实现向粪肠球菌的转移，而在无特定病原体（SPF）小鼠中未发现水平转移[45]。同样从酸奶发酵剂分离的红霉素抗性的德氏乳杆菌保加利亚亚种，携带有编码外排泵蛋白的msrC基因。但在SPF级裸鼠肠道也未检测到msrC基因转移[46]，作者推测肠道微生物群落可能作为保护屏障，发挥抑制耐药性转移的作用。Toomey等[47]发现在发酵乳基质中乳酸乳球菌477的四环素耐药基因tetM能够转移至乳酸乳杆菌BU-2-60中，表明在发酵乳等食品基质中耐药基因也能够在不同的细菌间进行水平转移。

4 结论

乳酸菌耐药性像一把“双刃剑”，一方面能够提高菌体在含有抗生素的环境中的存活率，另一方面也存在耐药基因向食品或肠道中其他微生物转移的风险，导致耐药基因的传播。食品、微生态制剂生产菌株的安全性是食品安全的重要保障，欧洲食品安全局（EFSA）强调[14]野生菌株到工业菌株的审批流程中应将抗生素敏感性测定作为必要的安全性指标，同时应对申报菌株的耐药基因及其可移动性在实验室水平和实际生产条件下进一步探究，并以长期安全性为原则，在菌株使用中及时监测其耐药性的变化，将风险降到最低。此外，鉴于乳酸菌在治疗抗生素相关性腹泻上已得到临床证明，乳酸菌固有耐药性的研究也为临床抗生素优化施用提供新思路[48]。固有耐药的益生菌株和抗生素联合施用，实现药物杀菌和菌群抑制的协同作用，既减少了抗生素的用量又为抗生素使用后肠道菌群恢复提供了益生菌补充。