GSK3β、TLR-4在早期胃癌患者中的表达及与Hp感染的相关性探究

包华鑫 孙元鹏

早期胃癌主要是指胃癌浸润深度在胃黏膜层或者是黏膜下层，研究结果显示早期胃癌患者5年存活率达90%以上，目前我国早期胃癌患者发现率较低，大部分患者一旦发现已经处于晚期，虽然我国手术、放疗、化疗效果不断提升，但是胃癌患者5年生存率只占40%[1-2]。临床中关于胃癌发病机制尚不明确，公认幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是导致胃癌发病的主要原因[3]。Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）家族属于一种模式识别受体，在机体免疫中发挥调节适应免疫作用，参与多种炎症相关恶性肿瘤发生、发展过程，在细胞损伤、组织重构及修复过程中常常作为传感器[4-5]。糖原合成酶激酶 -3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶其具有多功能作用，参与糖代谢、细胞增殖、凋亡等过程，并且在多种肿瘤中显示异常表达[6]。目前缺少GSK3β、TLR-4表达与胃癌Hp感染的相关研究。鉴于此，本研究回顾性分析海安市中医院收治的94例早期胃癌患者临床资料，探讨GSK3β、TLR-4表达与早期胃癌患者Hp感染的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本文选取2018年11月-2020年11月在本院就诊的早期胃癌患者94例，纳入标准：患者均经过胃镜、病理学检查确诊为胃癌；患者临床分为Ⅰ、Ⅱ期；患者均符合文献[7]中华医学会消化内镜学分会制定的中关于早期胃癌的诊断标准。排除标准：合并其他恶性肿瘤；进行放疗、化疗抗肿瘤治疗；妊娠期、哺乳期患者；精神异常；合并其他感染性疾病；近1个月服用抗生素、质子泵抑制剂、铋制剂等药物。早期胃癌患者中，男60例，女34例，年龄 35～70 岁，BMI 21～26 kg/m2；其中 Hp 感染阳性40例为阳性胃癌组，Hp感染阴性54例为阴性胃癌组。选取同时期在本院健康体检正常志愿者30例为对照组，男20例，女10例，年龄32～70岁，BMI 20～25 kg/m2。三组性别、年龄、BMI、胃癌家族史等临床基线资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。阳性胃癌组与阴性胃癌组病灶直径、病灶位置等基线资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性，见表2。本文研究患者及其家属均知情，签署知情同意书，研究经过本院伦理委员会批准。

表1 三组临床基线资料比较

表2 阳性胃癌组与阴性胃癌组基线资料比较

表2（续）

1.2 方法

采用13C呼气法检测患者Hp感染：患者在检查前1个月停止服用抗生素、质子泵抑制剂、铋制剂等药物，在患者空腹下进行，检查前患者先在集气袋中吹气，之后口服13C胶囊，25 min后，患者向另一个集气袋中吹气，通过13C检测呼吸仪观察患者Hp感染结果。采集三组研究对象入院当天空腹肘部静脉血 3 ml，2 000 r/min 离心处理 5 min，转速为 2 000 r/min 离心干预 5 min，-20 ℃保持。采集到的血液标本，通过1 000 r/min离心处理后提取沉淀，滴加裂解液、反复冻融后，120 000 r/min离心处理，提取上清液，采用酶标仪检测GSK3β、TLR-4蛋白浓度，保存。滴加10%的分离胶，封闭，吸干水分，给予5%的浓缩胶灌注，凝固后，将其在电泳槽中固定，加5μl Marker、变性蛋白样品，电泳干预30 min，待蛋白分离胶底，结束电泳；转膜成功后将硝酸纤维素膜（nitrocellulosefilter membrane，NC）膜在5%的脱脂奶粉中封闭固定1 h，加一抗（GSK3β、TLR-4 1∶1 000）孵育，经过震荡洗膜后加二抗（GSK3β、TLR-4 1∶10 000），孵育，再次震荡洗膜，使用红外荧光成像系统对结果给予分析。以GAPDH为内参。

1.3 统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行数据处理。计量资料以（±s）表示，组间两两对比采用独立样本t检验，三组间比较采用方差齐性检验；以率（%）表示计数资料采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operator characteristics，ROC）曲线分析GSK3β、TLR-4对早期胃癌患者Hp感染的预测价值；相关性采用Spearman分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSK3β、TLR-4表达比较

与对照组相比，阳性胃癌组、阴性胃癌组GSK3β表达高，TLR-4表达低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与阴性胃癌组相比，阳性胃癌组GSK3β表达高，TLR-4表达低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 3。

表3 三组GSK3β、TLR-4表达比较（±s）

表3 三组GSK3β、TLR-4表达比较（±s）

*与对照组相比，P＜0.05；#与阴性胃癌组相比，P＜0.05。

组别 GSK3β TLR-4阳性胃癌组（n=40） 1.35±0.15*# 0.43±0.09*#阴性胃癌组（n=54） 1.02±0.10* 0.86±0.08*对照组（n=30） 0.45±0.05 1.16±0.25 F值 47.290 25.626 P值 0.001 0.001

2.2 GSK3β、TLR-4对早期胃癌患者Hp感染的预测价值

ROC曲线分析血清GSK3β、TLR-4预测早期胃癌患者Hp感染的曲线下面积（area under the curve，AUC） 分 别 为 0.745（95%CI：0.648，0.842，P=0.001）、0.721（95%CI：0.619，0.821，P=0.001），见表4、图1。

表4 GSK3β、TLR-4诊断早期胃癌患者Hp感染的效能

图1 GSK3β、TLR-4诊断早期胃癌患者Hp感染的ROC曲线

2.3 GSK3β、TLR-4表达与早期胃癌患者Hp感染的相关性

采用Spearman相关性分析，以1表示Hp感染为阴性，以2表示Hp感染为阳性。GSK3β表达与Hp感染呈正相关（r=0.483，P=0.001）；TLR-4表达与Hp感染呈负相关（r=-0.538，P=0.001）。

3 讨论

大部分早期胃癌患者临床表现不明显，所以导致早期胃癌患者检出率较低，在临床中主要通过胃镜直接观察患者胃黏膜状况，诊断胃癌的金标准是病理组织学检测，但是其具有侵入性、价格高等缺点，部分患者依从性、耐受性较差，因此选择操作简单、无创、敏感性高的检查手段对患者来说至关重要[8-9]。本研究通过ROC曲线，GSK3β、TLR-4表达均与早期胃癌患者Hp感染的独立相关，提示GSK3β、TLR-4表达可以作为临床预测早期胃癌Hp感染的预测指标。

Hp在患者胃黏膜损伤中属于一种攻击性因子，一旦革兰阴性菌发生繁殖和崩解会释放大量的脂多糖，将免疫系统激活，发挥着双重作用：一方面对感染有一定的抵御作用；另一方面是对组织产生一定的损伤[10-11]。Hp感染导致癌症发生的途径较多，主要是加快硝酸盐向亚硝酸盐转变进程，从而将胃黏膜环境改变，产生大量的细胞毒素相关基因A（CagA）、空泡毒素A（VacA）等毒性物质[12]。

研究数据显示，在肿瘤细胞中有TLRs表达，TLRs信号参与肿瘤免疫逃逸、发展过程，与机体炎症反应及免疫调节相关[13]。TLR-4主要存在于巨噬细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞表面，发挥免疫作用。本研究中阳性、阴性早期胃癌患者血清TLR-4表达较高，其中阳性早期胃癌患者TLR-4表达高于阴性早期胃癌患者，提示早期胃癌患者TLR-4表达异常是导致早期胃癌患者Hp感染的危险因素，增加Hp感染风险。胃癌细胞不断增殖会导致大量正常细胞发生坏死和凋亡，释放大量的TLRs配体，TLRs会对肿瘤细胞产生刺激，死亡细胞发生“sterile”炎症反应，导致患者病情不断发展[14-15]。Li等[16]研究认为，在胃黏膜细胞表面存在的TLR4 mRNA能激活Hp的脂多糖介导转换生长因子β活化酶发生磷酸化，提示Hp通过调节TLR4信号转导，引起慢性萎缩性胃炎胃黏膜表面上皮细胞坏死速度加快。本研究ROC分析显示TLR-4预测早期胃癌Hp感染的AUC达0.721，敏感度和特异度分别为92.50%、57.40%，提示血清TLR-4可用于评估早期胃癌Hp感染发生风险。

在肿瘤研究结果中，GSK-3β在Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信号通路中均有重要的参与作用，对磷酸化/去磷酸化过程发挥活性调节作用[17-18]。也有研究指出GSK-3β具有双向调节作用，GSK-3β通过调节p53基因促进肿瘤细胞凋亡，对正常细胞生长有一定的抑制作用；此外，通过对维持NF-κB表达，抑制肿瘤细胞生长，促进正常细胞生长[19]。本研究阳性胃癌患者血清GSK3β表达低于阴性胃癌患者和对照组，且GSK3β表达与早期胃癌患者Hp感染存在密切关系，提示血清CysC水平升高是导致早期胃癌患者Hp感染的危险因素。杨学丽等[20]研究指出，GSK3β低表达对胃癌细胞增殖有明显的促进作用，加快解聚APC/GSK3β/β-catenin复合物，造成β-catenin在细胞核内不断积聚、活化，导致胃癌不断转移、浸润。本研究ROC曲线分析显示GSK3β预测早期胃癌Hp感染的AUC达0.745，提示GSK3β是早期胃癌Hp感染的警示指标。

本文Spearman研究结果证实，TLR-4表达水平与Hp感染呈负相关。蔡兆根等[21]研究指出，在Hp感染胃黏膜上皮组织中TLR4阳性表达占83.53%，提示Hp感染与TLR4呈正相关，提示胃癌患者Hp感染伴随TLR-4介导机体免疫应答发生。本文研究结果与其研究不一致，分析原因，本文旨在研究早期胃癌患者血清中TLR-4表达水平变化状况，未研究患者免疫组化状况。本文中，GSK3β表达水平与Hp感染呈正相关。

综上所述，早期胃癌Hp感染患者GSK3β、TLR-4表达异常，GSK3β、TLR-4表达水平高低与Hp感染具有相关性，GSK3β、TLR-4是早期胃癌Hp感染的风险预测因子。