亚麻酸处理对苹果果实愈伤的促进作用及相关机理

贾菊艳，李宝军，王 斌，余丽蓉，赵诗佳，毕 阳,*，Dov PRUSKY,2

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.以色列农业研究组织农产品采后科学部，以色列 里雄莱锡安 7505101）

苹果果实具有自我愈伤的能力，可通过在伤口处积累多酚及木质素从而形成物理屏障来抑制病原菌侵染、减少水分蒸腾[1]。由于苹果果实自然愈伤所需时间较长，因此可通过采取适当措施加速愈伤。前期研究发现，热水处理可通过提高抗性酶的活性以及总酚和木质素含量，从而促进苹果果实愈伤[2]。同样，季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）也可通过增加抗性酶活性以及总酚、类黄酮和木质素含量来促进苹果果实愈伤[3]。

有报道表明，当植物受到逆境胁迫时，膜上不饱和脂肪酸的氧化改变了膜的通透性，使细胞内Ca2+浓度升高，在Ca2+和钙离子调节素（calmodulin，CaM）作用下，磷脂酶A2被激活，促使磷脂释放亚麻酸（linolenic acid，LA）[4]。LA是重要的不饱和脂肪酸[5]，在植物响应逆境胁迫及调节生长发育方面具有重要作用[6]。LA处理可减轻由Phytophthora infestans引起的马铃薯叶片晚疫病[7]，并通过促进乙烯产生、提高过氧化物酶活性和木质素含量来增强马铃薯块茎对Phytophthora infestans的抗性[8]。LA处理还可通过增加不饱和脂肪酸含量来提高青椒果实的抗寒性[9]。此外，LA处理可通过提高α-淀粉酶活性来缓解干旱对水稻幼根和幼苗生长的抑制作用[10]，还可增加烟草叶片中的超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量来促进烟草生长[11]。

尽管已有LA增强作物对生物和非生物胁迫抗性及相关机制的报道，但LA处理是否影响苹果果实愈伤尚鲜见报道。因此，本研究用1 mmol/L LA处理人工模拟损伤的‘富士’苹果，测定愈伤期间损伤果实的质量损失率和损伤接种果实的病情指数，分析果实伤口处苯丙烷代谢关键酶活力和代谢产物含量，以及H2O2含量和过氧化物酶活性，以评价LA处理对苹果果实愈伤的作用效果。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

Penicillium expansum（T01）由中国科学院植物研究所田世平教授提供，于PDA培养基上保存待用。

‘富士’苹果采自景泰县商业果园，先将大小均匀、无机械损伤、无病虫害的果实单果套网袋后装箱，当天运至本实验室，在冷库中（（4±2）℃、相对湿度55%～65%）贮藏待用，共用果实150个。

LA购自上海麦克林生化科技有限公司产品（纯度70%，相对分子质量278.44），于4 ℃冰箱保存备用；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450型紫外-可见光分光光度计 日本岛津仪器有限公司；MT201型电子秤 深圳市美孚电子有限公司；H-1850R型高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；Centri Vap真空离心浓缩仪 美国Labconco公司；ACQUITY Arc四元梯度超高效液相色谱仪 美国Waters公司；1510-04087型酶标仪 赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；A11 basic S025型研磨机 艾卡（广州）仪器设备有限公司；LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；CX21FS1C型正置万能显微镜 日本Olympus公司；HWS24型电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LA溶液的制备

取0.560 mL LA，用1 mL体积分数95%乙醇溶液溶解，将LA乳液超声振荡（频率68 kHz、功率900 W）40 s至乳白色，然后加无菌水搅拌并定容至2 000 mL，按前期实验筛选结果配制成1 mmol/L母液[9]。

1.3.2 苹果果实人工损伤及愈伤处理

果实从冷库中取出回温24 h，进行预处理（自来水清洗，体积分数1%次氯酸钠溶液消毒，自来水二次清洗，晾干），之后在果实赤道部位用刮皮刀刮出3个圆形伤口（直径15 mm、深1 mm），5 min后用1 mmol/L LA溶液浸泡处理10 min，以含微量乙醇（1 mL体积分数95%乙醇溶液）的无菌水浸泡为对照。处理和对照果实于常温（20～25 ℃、相对湿度80%～85%）避光条件下进行愈伤[3]。

1.3.3 愈伤效果评价

1.3.3.1 质量损失率的测定

分别在果实愈伤的第0、0.5、1、3、5、7天称量单果质量，质量损失率按式（1）计算[12]。每个处理9个果实，重复3 次。

1.3.3.2 病情指数的测定

配制1×105个/mL的P. expansum孢子悬浮液。分别于果实愈伤第0、1、3、5、7天在伤口处接种20 μL孢子悬浮液，放入聚乙烯保鲜袋后，于常温（20～25 ℃、相对湿度80%～85%）避光条件下培养，3 d后观察发病级别[13]。病情指数按式（2）计算。每个处理9个果实，重复3 次。

式中：发病级别0、1、2、3、4、5级标准分别对应伤口表面0、0～25%、25%～50%、50%～75%、75%～100%和100%发病。

1.3.4 生化指标测定前取样

在果实愈伤第0、0.5、1、3、5、7天用灭菌手术刀取伤口下2～3 mm厚的组织，液氮冷冻后用研样机研磨，粉末装入离心管，-80 ℃保存备用[3]。每个处理15个果实，重复3 次。

1.3.5 苯丙烷代谢关键酶活力的测定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）活力的测定参照季悦等[14]的方法，以每分钟OD290nm变化0.01为1个酶活力单位，PAL活力单位为U/gmf。肉桂酸-4-羟化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）活力的测定参照王斌等[15]的方法，以每分钟OD340nm变化0.01为1个酶活力单位，C4H活力单位为U/gmf。4-香豆酰辅酶A连接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase，4CL）活力的测定参照Liu Yaoyao等[16]的方法，以每分钟OD333nm变化0.01为1个酶活力单位，4CL活力单位为U/gmf。肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力的测定参照Goffner等[17]的方法，以每分钟OD340nm变化0.01为1个酶活力单位，CAD活力单位为U/gmf。过氧化物酶（peroxidase，POD）活力的测定参照Venisse等[18]的方法，以每分钟OD470nm变化0.01为1个酶活力单位，POD活力单位为U/gmf。

1.3.6 4种酚酸和3种木质素单体的含量测定

参照Gruz等[19]的方法。取1.0 g冷冻粉末，加3 mL体积分数70%甲醇溶液，常温40 Hz超声提取30 min，8 000×g离心20 min，上清液经浓缩仪浓缩，1 mL甲醇复溶后过膜（0.22 μm微孔滤膜），将滤液移至自动进样瓶，用Symmetry®C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行四元梯度超高效液相色谱仪分析。液相色谱条件：以100%甲醇（A）和体积分数1%乙酸溶液（B）为流动相。按0～10 min 30% A、70% B，10～12 min 45% A、55% B，12～15 min 65% A、35% B，15～18 min 30% A、70% B，18～20 min 30% A、70% B，18～20 min 30% A、70% B以0.8 mL/min流速、5 μL进样量进行梯度洗脱。根据325 nm波长处吸光度检测芥子酸和咖啡酸，276 nm波长处吸光度检测肉桂酸，322 nm波长处吸光度检测阿魏酸，273 nm波长处吸光度检测肉桂醇和芥子醇，263 nm波长处吸光度检测松柏醇。通过对比标准化合物的保留时间进行定性。以标准曲线计算样品中各酚酸和木质素单体的质量浓度，4种酚酸和3种木质素单体含量均以μg/gmf表示。

1.3.7 总酚和类黄酮含量的测定

参照Scalbert[20]和Cvek[21]等的分光光度法，分别在760 nm和510 nm波长处测定吸光度并计算总酚含量和类黄酮含量。其中，总酚含量的计算：以没食子酸为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算，结果以每100 g样品所含没食子酸质量计，单位为mg/100 gmf；类黄酮含量的计算：以儿茶素为标准品绘制标准曲线，通过标准曲线方程计算，结果以每100 g样品所含儿茶素质量计，单位为mg/100 gmf。

1.3.8 木质素和H2O2含量的测定

木质素含量参照Morrisson等[22]的方法进行测定，单位为OD280nm/gmf。H2O2含量参照Prochazkova等[23]的方法进行测定，单位为μmol/gmf。

1.4 数据统计与分析

各项指标测定至少重复3 次。全部数据用Excel 2019软件计算平均值±标准差，用SPSS 21.0软件进行t检验（以P＜0.05表示差异显著）及皮尔逊相关性分析，用Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 LA处理对愈伤期间苹果果实质量损失率和病情指数的影响

LA处理显著抑制了愈伤期间损伤果实的质量损失（P＜0.05），第3天时低于对照组32.48%（图1A）。LA处理还显著降低了损伤接种果实的病情指数（P＜0.05），第3天时低于对照组39.58%（图1B）。上述结果表明，LA处理促进了苹果果实的愈伤。

图1 LA处理后损伤果实质量损失率（A）和损伤接种果实病情指数（B）的变化Fig. 1 Changes in mass loss (A) of wounded fruit and disease index (B)of inoculated fruit after treated with LA

2.2 LA处理对愈伤期间果实伤口处PAL、C4H、4CL和CAD活力的影响

苯丙烷代谢关键酶活力决定酚类物质的合成水平。愈伤期间，LA处理显著提高了果实伤口处的PAL活力（P＜0.05），第5天时LA处理果实的PAL活力高出对照87.39%（图2A）。LA处理显著提高了果实伤口处的C4H活力（P＜0.05），第0.5天时高出对照57.21%（图2B）。LA处理还显著提高了4CL和CAD活力（P＜0.05），4CL活力在第3天时高出对照3.84%（图2C），CAD活力在第3天时高出对照50.24%（图2D）。上述结果表明，LA处理提高了果实伤口处的PAL、C4H、4CL和CAD活性。

图2 LA处理后果实伤口处PAL（A）、C4H（B）、4CL（C）和CAD（D）的活力变化Fig. 2 Changes in PAL (A), C4H (B), 4CL (C) and CAD (D) activities at wounds of fruit treated with LA

2.3 LA处理对愈伤期间果实伤口处4种酚酸以及总酚和类黄酮含量的影响

酚酸、总酚及类黄酮是苯丙烷代谢的重要产物。LA处理提高了愈伤期间果实伤口处的芥子酸、阿魏酸、肉桂酸和咖啡酸含量，分别在第5、3、7天和第0.5天时高出对照23.08%、22.24%、7.13%和21.17%（图3A～D），处理果实伤口处的总酚和类黄酮含量也显著高于对照（P＜0.05），第5天时分别高出对照7.06%和27.99%（图3E、F）。上述结果表明，LA处理促进了果实伤口处芥子酸、阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、总酚和类黄酮的合成。

图3 LA处理后果实伤口处芥子酸（A）、阿魏酸（B）、肉桂酸（C）、咖啡酸（D）、总酚（E）和类黄酮（F）含量的变化Fig. 3 Changes in contents of erucic acid (A), ferulic acid (B), cinnamic acid (C), caffeic acid (D), total phenols (E) and flavonoids (F) at wounds of fruit treated with LA

2.4 LA处理对愈伤期间果实伤口处松柏醇、肉桂醇、芥子醇和木质素含量的影响

LA处理提高了果实伤口处的松柏醇含量，第7天时高出对照18.98%（图4A）。LA处理显著提高了果实伤口处的肉桂醇和芥子醇含量（P＜0.05），第7天时分别高出对照16.47%（图4B）和30.43%（图4C）。LA处理还提高了果实伤口处的木质素含量，第5天时高出对照1.00%（图4D）。上述结果表明，LA处理促进了果实伤口处松柏醇、肉桂醇和芥子醇以及木质素的合成。

图4 LA处理后果实伤口处松柏醇（A）、肉桂醇（B）、芥子醇（C）和木质素（D）含量的变化Fig. 4 Changes in coniferyl alcohol (A), cinnamyl alcohol (B), sinapyl alcohol (C) and lignin (D) contents at wounds of fruit treated with LA

2.5 LA处理对愈伤期间果实伤口处H2O2含量和POD活力的影响

愈伤期间，LA处理果实伤口处的H2O2含量先升高后降低再升高，第1天时LA处理果实伤口处H2O2含量高出对照28.29%（图5A）。愈伤期间，LA处理显著提高了果实伤口处的POD活力（P＜0.05），第5天时LA处理果实伤口处的POD活力高出对照86.19%（图5B）。上述结果表明，LA处理提高了果实伤口处的H2O2含量以及POD活力。

图5 LA处理后果实伤口处H2O2含量（A）和POD活力（B）的变化Fig. 5 Changes in H2O2 content (A) and POD activity (B) at wounds of fruit treated with LA

2.6 木质素含量与质量损失率和病情指数间的相关性分析结果

由表1可知，木质素含量与质量损失率之间具有显著正相关性（r＝0.802），木质素含量与病情指数之间具有极显著负相关性（r＝-0.866）。上述结果表明，LA处理主要通过促进愈伤期间果实伤口处木质素的沉积来降低苹果果实的质量损失率和病情指数。

表1 木质素含量与质量损失率和病情指数间的相关性Table 1 Correlation among mass loss, disease index and lignin content

3 讨 论

苯丙烷代谢既可为愈伤组织的形成提供底物，又可产生具有抗菌和抗氧化活性的酚类物质[24]。PAL催化苯丙烷代谢的第一步反应，将L-苯丙氨酸脱氨转化为反式肉桂酸[25]。反式肉桂酸在C4H的催化下可生成多种酚酸[26]。本研究发现，LA处理激活了愈伤期间苹果果实伤口处的PAL和C4H活性（图2），增加了4种酚酸的含量（图3）。该结果与LA处理提高马铃薯块茎PAL活性以及酚类物质含量的结果[27]类似。4CL是苯丙烷代谢过程中控制形成不同木质素单体的酶，能够调控木质素单体的合成[28]。4CL以C4H的催化产物酚酸类物质为底物，生成相应的酚酸-辅酶A，这些酚酸-辅酶A在肉桂酰辅酶A还原酶的催化下形成松柏醛、肉桂醛和芥子醛，通过CAD将相应的醛类物质转化为松柏醇、肉桂醇和芥子醇等木质素单体[29]。本研究还发现，LA处理提高了愈伤期间果实伤口处的4CL和CAD活性（图2），增加了松柏醇、肉桂醇和芥子醇的含量（图4）。有研究表明，LA是植物体内脂氧合酶途径的底物[30]。当植物受到逆境胁迫时，磷脂酶A2被激活，水解磷脂释放LA，LA经十八烷酸途径进一步合成茉莉酸（jasmonate，JA）[31-32]。有研究发现，LA处理可提高葡萄果实内源JA和脱落酸含量[33]；也有研究发现，低浓度的JA可诱导PAL、几丁质酶等的表达[34]；此外，JA还可促进烟草植株中酚类化合物的积累[35]。因此推测，LA可能先参与了果实伤口处JA的合成，然后JA作为信号分子激活了苯丙烷代谢。

木质素主要由松柏醇、芥子醇和香豆醇3种单体通过碳-碳键、醚键和酯键聚合而成[36]，该过程需要H2O2和POD的参与[37]。本研究发现，LA处理提高了果实伤口处的H2O2含量和POD活性（图5），促进了木质素合成（图4）。愈伤期间的H2O2主要来源于NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX），NOX通过转移NADPH的电子给O2产生超氧阴离子，超氧阴离子在超氧化物歧化酶作用下很快歧化成H2O2[38]。有报道表明，JA可提高拟南芥叶片中H2O2的含量[39]。据此推测，LA可通过调控内源JA的生成来促进H2O2产生，至于LA如何调控H2O2的积累有待进一步研究。

木质素是果实伤口处愈伤组织的主要成分，具有强化细胞壁、增加机械强度、维持植物细胞壁结构完整性、形成物理屏障以阻隔病原菌的作用[40]。相关性分析结果表明，LA处理果实伤口处的木质素含量与质量损失率和病情指数分别呈显著正相关和极显著负相关（r＝0.802，r＝-0.866），因此认为，LA处理主要通过促进果实伤口处木质素的沉积来降低愈伤期间果实的质量损失率和病情指数。此外，处理果实病情指数的降低还与伤口处总酚和类黄酮含量的增加有关（图3E、F），这些酚类化合物具有抗菌活性[22]，对真菌孢子萌发和菌丝生长具有明显的抑制效果[41]。由于LA处理对P. expansum的菌落生长无显著影响，故可知处理果实病情指数的降低是LA激活苯丙烷代谢导致酚酸和类黄酮积累的结果。

4 结 论

LA处理提高了苹果果实伤口处的PAL、C4H、4CL和CAD活力，促进了芥子酸、阿魏酸、肉桂酸和咖啡酸以及松柏醇、肉桂醇和芥子醇的合成，增加了总酚、类黄酮和木质素含量。此外，LA处理还提高了果实伤口处的H2O2含量和POD活力。上述木质素单体在H2O2和POD的共同作用下聚合成木质素在伤口处沉积，从而显著降低了愈伤期间损伤果实的质量损失率和损伤接种果实的病情指数，促进了苹果果实愈伤。鉴于LA处理对苹果果实愈伤的良好促进效果，可考虑将其作为一种果实促愈剂进行开发。由于LA促进果实愈伤的机理涉及多种代谢及伤口处的组织结构变化，尚需进一步深入研究。