中国母亲母乳氨基酸模式的构建

任乐乐，逄金柱，米丽娟，李依璇，郑丽敏,*

（1.中国农业大学信息与电气工程学院，北京 100083；2.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，北京 101107；3.中国农业大学营养与健康研究院，教育部北京市共建功能乳品重点实验室，北京 100083）

母乳是婴儿最佳营养来源，对婴儿的生长发育有短期和长期的好处[1]。世界卫生组织建议出生后6 月龄内进行纯母乳喂养，并可以继续母乳喂养直至2 周岁甚至更久。但是对于母乳喂养不足或不能实现母乳喂养的婴儿，为满足其生长发育的营养需求，婴幼儿配方奶粉（以下简称婴配粉）成为母乳的最佳代替品。近年来，婴配粉的营养基础研究受到广泛关注，为了尽可能地模拟母乳的成分，进行包括一些生物活性物质的细微调整等多种策略[2]，母乳化是婴配粉营养基础研究的准则，加强婴配粉的母乳化研究，明确母乳中的营养成分至关重要。

蛋白质是母乳中最重要的营养成分之一，蛋白质不仅为婴儿提供14.06%的能量[3]，还通过多种代谢途径参与婴幼儿身体组织结构和功能的发育[4]。蛋白质的营养取决于各种氨基酸组成情况，母乳中的氨基酸是婴儿合成蛋白质及其他物质的重要来源[5]。母乳中的氨基酸能够为婴儿直接提供营养物质，并且能够提升婴儿的免疫能力及促进脑部发育。氨基酸含量在不同泌乳阶段是动态变化的，随泌乳时间的延长，各氨基酸含量都呈现出下降趋势，但是各氨基酸含量在总氨基酸中的占比保持稳定[6]。有研究表明，不同民族、地理位置母亲的母乳氨基酸含量随泌乳时间延长的变化趋势一致[7]，但是目前对于影响母乳中氨基酸含量的因素还知之甚少。婴幼儿的氨基酸需求会随着年龄增长发生变化，因此需要明确不同泌乳阶段母乳氨基酸模式组成，并开发相应的婴配粉产品，以满足婴儿生长发育需要。

母乳中的氨基酸模式适合婴幼儿生长发育需求[8]，在婴配粉研发过程中，多以某地区母乳的营养成分作为研究基础，提出适合该地区的氨基酸组成模式。而母乳营养成分数据采集困难，鲜有公开的母乳营养成分库，很难对母乳成分影响因素分类讨论，提出的氨基酸组成模式较为单一。目前国际母乳氨基酸模式研究鲜有基于中国母乳营养特征[9-10]，难以明确其氨基酸组成模式是否符合中国婴幼儿生长发育需要。因此，建立中国母乳氨基酸组成模式对于指导中国婴配粉母乳化研究及营养学基础研究具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

母乳募集自北京、济南、包头、成都、昆明、深圳、南京、西宁的240 名产妇，年龄18～38 岁，身体健康，婴儿身体健康，所有产妇母乳喂养婴儿12个月。所有产妇均署了知情同意书。

36%（质量分数）盐酸、苯酚、柠檬酸钠、硫酸、氢氧化钠、硫酸钾、硫酸铜、溴甲酚绿、甲基红、硼酸（均为分析纯） 天津市永大化学试剂有限公司；5-甲基-DL-色氨酸（分析纯） 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；甲醇（色谱纯） 美国Fisher Scientific公司；磷酸二氢钠（色谱纯） 美国Acros Organics公司。

1.2 仪器与设备

L-8900氨基酸自动分析仪 日本日立公司；Kjeltec 8400凯氏定氮仪 丹麦福斯公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳收集及保存

母乳成分具有明显的昼夜节律变化[11]，由统一培训的科研人员于上午9：00—11：00在医院或入户开展问卷调查及母乳采集，问卷信息主要包括母亲与婴儿基本信息，母亲基本信息主要包括：年龄、民族（汉族或少数民族）、地域（南方（成都、昆明、深圳、南京）和北方（北京、济南、包头、西宁））、产次（第1、2次分娩）、分娩季节（冬春季（11—12月及1—4月）和夏秋季（5—10月））、产前体质量、孕前体质量、产后12个月体质量、分娩方式（剖宫产、正常分娩）、孕期疾病、服用营养素情况以及患病史。婴儿基本信息主要包括出生日期、出生体质量、出生身长、性别、出生情况（足月、早产）以及患有疾病情况等。母乳采集使用项目组统一配备的电动吸奶器采空单侧乳房的全部乳汁并分装，纵向采集10 次，包括初乳1 次（产后1～7 d，共收集171 份有效样本），过渡乳1 次（产后8～14 d，共收集143 份有效样本），早期成熟乳6 次（产后15～180 d，共收集1 028 份有效样本）及晚期成熟乳2 次（产后181～360 d，共收集298 份有效样本），采集后的母乳于-80 ℃保存备用，最终收集206 位母亲有效母乳样本共1 640 份。

1.3.2 氨基酸及蛋白质水平测定

目前可用于人乳氨基酸含量测定的常见方法主要有氨基酸自动分析法[12]、气相色谱法[13]、高效液色谱法[14]等。氨基酸自动分析仪具有样品制备简单、结果可靠、适用于大量常规样本检测等优点，因此本研究采用L-8900氨基酸自动分析仪测定母乳中氨基酸质量浓度。样品送至北京市营养源研究所有限公司测定母乳中18种氨基酸的质量浓度（其中16种氨基酸质量浓度测定参考GB/T 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》，半胱氨酸和色氨酸质量浓度测定采用该公司开发建立的检测方法）。以100 mL母乳中某氨基酸质量浓度与总蛋白质量浓度的比值计，单位为mg/g。根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》采用凯氏定氮法测定母乳中蛋白质含量（单位为mg/g），每个样品测定2 次，结果取平均值。

1.4 数据分析与处理

实验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 22.0软件进行数据分析与处理，采用Origin 2016软件作图。采用Excel软件构建母乳营养成分库，其中包含产妇基本信息、婴儿基本信息、母乳氨基酸含量。采用独立样本t检验进行显著性分析，采用欧氏距离（式（1））表征不同母乳样本的相似度。欧氏距离越小表示母乳氨基酸模式越相似，通过欧氏距离筛选了80%母乳样本，得出推荐母乳氨基酸模式。按式（1）、（2）计算母乳氨基酸的平均欧氏距离。

式中：D（mi，mj）为母乳样本i和母乳样本j之间的距离；aa1～aa18和bb1～bb18分别表示母乳样本i和j中的18种氨基酸含量。

式中：D（mi）为当前母乳样本到总体样本的平均欧氏距离；n表示母乳样本个数。

2 结果与分析

2.1 产妇及婴儿的基本信息

首先根据方差同质检验分析母亲信息与婴儿的基本信息数据是否服从正态分布，当满足正态分布时采用单因素方差分析比较组间差异[15]，否则采用Mann-Whitney U检验进行显著性分析。由表1可知，地域对于母亲和婴儿均具有显著影响：南方母亲生育年龄极显著大于北方母亲（P＜0.01），而北方母亲孕前体质量、产前体质量及产后12个月体质量均极显著高于南方母亲（P＜0.01），北方婴儿出生体质量与出生身长与南方婴儿也具有显著性差异（P＜0.05）。在分娩方式影响因素下，剖宫产母亲生育年龄显著大于正常分娩的母亲（P＜0.05），同时剖宫产分娩的婴儿体质量极显著高于正常分娩婴儿体质量（P＜0.01）。年龄影响因素下，因以年龄对数据进行分类，仅生育年龄具有显著性差异（P＜0.01），其他信息均无显著差异。民族影响因素下，少数民族母亲产后12个月体质量显著大于汉族母亲（P＜0.05），但是由于少数民族母亲样本数较小，关于民族因素对母亲和婴儿的影响需要扩充数据库进一步探讨。分娩季节因素下，夏秋季分娩的母亲孕前体质量显著大于冬春季母亲（P＜0.05）。出生情况影响因素下，早产儿的体质量及身长均极显著低于足月儿（P＜0.01）。产次影响因素下，第1次分娩母亲年龄显著小于第2次分娩母亲（P＜0.05）。

表1 母亲和婴儿基本信息统计分析结果Table 1 Statistical analysis of basic information of nursing mothers and infants

2.2 母乳氨基酸模式影响因素

2.2.1 地域对母乳氨基酸模式的影响

本研究采集了8个城市母乳数据，其中南方城市母亲106 名，北方城市母亲100 名，如表2所示，4个泌乳时期中南方和北方母乳氨基酸含量结果表明地域因素对于初乳没有显著影响（P＞0.05），而北方城市母亲过渡乳中丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量显著高于南方城市（P＜0.05），早期成熟乳中具有显著差异氨基酸数量达到了9种，晚期成熟乳含量差异氨基酸数量为6种，且均表现为北方氨基酸含量显著高于南方。

表2 不同泌乳阶段南北方母乳中氨基酸含量Table 2 Amino acid composition of breast milk from north and south China at different lactation stages mg/g

2.2.2 产次对母乳氨基酸模式的影响

本研究募集了第1次分娩母亲167 名，第2次分娩母亲39 名。不同产次下氨基酸占比随泌乳时期的变化如图1所示，组氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸在总氨基酸中占比随泌乳时间的延长均呈现出下降的趋势，赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸和脯氨酸均呈现出上升的趋势。比较不同产次母乳中各氨基酸占比可知，第1次分娩母乳中谷氨酸占比在晚期成熟乳阶段达到最大值，第2次分娩母乳中谷氨酸占比在早期成熟乳阶段即达到峰值并与晚期成熟乳中的谷氨酸占比相近，其他氨基酸占比变化趋势相似。

图1 不同产次母亲的不同泌乳期乳汁中氨基酸占比变化Fig. 1 Change in relative contents of amino acids in break milk from different parities during different lactation periods

不同产次的初乳和过渡乳氨基酸模式没有明显差异，但是在早期成熟乳和晚期成熟乳中，第2次分娩母乳中甘氨酸占比明显高于第1次分娩母乳。

2.2.3 分娩季节对母乳氨基酸模式的影响

不同季节温度、湿度也不同，已有研究表明牛乳、羊乳中多种营养成分呈现出季节性的变化[16]，且冬春季分娩牛乳的部分营养成分含量要显著高于夏秋季[17]。本研究募集冬春季分娩母亲86 名，夏秋季分娩母亲120 名，探讨了母乳不同泌乳阶段中氨基酸模式季节性变化。如表3所示，不同季节分娩母亲的各泌乳阶段氨基酸含量存在明显，初乳时期氨基酸含量不会受到季节因素的影响，而随泌乳时间的延长，季节因素会极显著影响半胱氨酸含量（P＜0.01）。在早期成熟乳阶段酪氨酸冬春季含量（（35.14±6.44）mg/g）极显著高于夏秋季（（32.22±6.04）mg/g）（P＜0.01），丙氨酸和天冬氨酸冬春季含量（分别为（32.8±2.38）、（77.27±4.49）mg/g）显著高于夏秋季（分别为（31.78±2.42）、（75.49±5.18）mg/g）（P＜0.05）；晚期成熟乳阶段冬春季丙氨酸和精氨酸含量（分别为（34.02±3.14）、（31.82±3.10）mg/g）极显著高于夏秋季（分别为（31.85±2.93）、（29.53±2.72）mg/g）（P＜0.01），天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸冬春季含量（分别为（76.38±6.08）、（40.06±3.36）、（163.64±16.17）mg/g）显著或极显著高于夏秋季（分别为（73.77±5.39）、（38.28±3.11）、（156.20±12.56）mg/g）（P＜0.05、P＜0.01）。分析结果表明季节因素对各泌乳阶段必需氨基酸含量均无明显影响。

表3 不同泌乳阶段冬春季与夏秋季母乳中氨基酸含量Table 3 Amino acid composition of breast milk from different seasons at different lactation stages mg/g

2.2.4 出生情况、分娩方式对母乳各氨基酸模式的影响

本研究根据婴儿出生情况对母乳进行划分，其中早产分娩母亲11 名，足月分娩母亲194 名。如表4所示，除足月分娩母亲早期成熟乳缬氨酸含量显著高于相同泌乳阶段早产分娩母亲母乳（P＜0.05），足月与早产对其他泌乳时期中氨基酸模式均无显著影响（P＞0.05）。另外根据母亲分娩方式进行划分，本研究中剖宫产母亲113 名，正常阴道分娩母亲93 名，如表5所示，初乳阶段正常分娩母亲母乳丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸含量显著高于剖宫产母亲（P＜0.05），分娩方式对于过渡乳和早期成熟乳各氨基酸含量没有显著影响（P＞0.05），而到晚期成熟乳阶段剖宫产母亲母乳蛋氨酸含量会显著高于正常分娩母亲（P＜0.05）。

表4 不同泌乳阶段早产儿与足月儿母乳中氨基酸含量Table 4 Amino acid composition of breast milk of premature and fullterm infants at different lactation stages mg/g

表5 不同泌乳阶段剖宫产与正常分娩母亲母乳中氨基酸含量Table 5 Amino acid composition of breast milk from caesarean section and normal delivery mothers at different lactation stages mg/g

2.3 氨基酸模式分析结果

2.3.1 氨基酸相似度分析

本研究采用欧氏距离衡量母乳相似度，计算每个母乳样本到其他全部母乳样本的平均距离，将其作为各母乳的氨基酸相似度，并对相似对进行排序。根据欧氏距离进行排序，得到的最小母乳模式与最大母乳模式如图2所示，各氨基酸含量差异非常明显。表6描述了最小母乳样本与最大母乳样本的欧氏平均距离，可以发现随泌乳时间的延长，母乳欧氏平均距离逐渐减小，进一步说明随泌乳时间的延长，各氨基酸含量趋于稳定。但是最大模式中晚期成熟乳欧氏平均距离产生波动，说明母乳样本中存在变异样本。因此为消除变异母乳带来的影响，本研究根据欧氏距离排序结果取80%母乳样本作为推荐母乳，提出了不同泌乳时期推荐母乳氨基酸模式（表7）。

图2 最小母乳样本与最大母乳样本模式Fig. 2 Recent breast milk and furthest breast milk sample patterns

表6 最大母乳样本与最小母乳样本欧氏平均距离Table 6 Average Euclidean distance from furthest breast milk to nearest breast milk

表7 推荐母乳氨基酸模式Table 7 Recommended breast milk amino acid pattern

2.3.2 不同影响因素氨基酸模式

通过分析地域、产次、分娩季节、出生情况、分娩方式5个因素对各泌乳时期母乳氨基酸含量的影响，可以看出地域和分娩季节对于早期成熟乳和晚期成熟乳影响均较大，因此，研究对筛选后的母乳样本根据地域和季节进行分类，提出针对南方和北方、冬春季和夏秋季的中国母亲泌乳模式（表8）。

表8 不同地域与分娩季节母乳氨基酸模式Table 8 Amino acid patterns of breast milk from different regions and delivery seasons mg/g

3 讨 论

研究共采集了206 名母亲不同泌乳期的1 640 份样本，分析比较了地域、产次、分娩季节、出生情况、分娩方式5个因素下我国不同泌乳阶段氨基酸模式及其变化趋势，丰富了我国母乳库数据，为后续制定我国婴幼儿氨基酸摄入标准以及婴幼儿配方粉的母乳化研究提供依据。

分析多种因素下母乳中氨基酸含量差异的文献相对较少，多见于关于某一因素的氨基酸含量差异，主要受限于样本采集、样本保存、监测等多方面因素，难以进行多维度的比较。近年来，逄金柱等[6]针对北京和深圳两地30 名健康乳母开展研究，探讨了地域因素对于母乳氨基酸质量浓度以及相对含量的影响。段一凡等[19]选取了来自11个省市区的20个调查点，分析了中国城市和农村间母乳氨基酸质量浓度的差异。Sundekilde等[20]研究表明早产儿母乳代谢组在产后5～7 周内发生变化，足月儿母乳与早产儿母乳的代谢组相似，说明母乳代谢组差异与妊娠时间无关。Zhang Zhiying等[10]系统分析了全世界妇女及各泌乳时期氨基酸浓度，从而确定妊娠时间、地理位置和泌乳阶段对母乳总氨基酸和游离氨基酸浓度的影响。翁梅倩等[21]以45 名产妇为研究对象，认为是否足月分娩对母乳中氨基酸含量有显著影响。关于分娩季节、分娩方式和产次对人乳氨基酸成分影响的研究较少，很多研究表明，季节因素对牛乳、羊乳的产奶量、营养成分均有显著影响[22-24]。本研究分析了分娩季节对人乳氨基酸含量的影响，研究结果表明分娩季节可以显著影响成熟乳阶段非必需氨基酸。近年来由于各种原因使剖宫产率、二胎率逐年上升，且剖宫产会导致产妇哺乳延迟，泌乳量减少[25-26]。产次和孕妇年龄、分娩方式相互影响，如二胎母亲通常年龄较大且高龄产妇通常需要剖宫产等。分析产次和分娩方式需要结合年龄进行多因素的分析，因此未来将会随样本数据的补充，进行这部分研究。

母乳中的氨基酸是婴儿合成体内蛋白质及其生物活性物质的重要来源，满足婴儿的生长发育需求[27-29]。母乳混合蛋白质氨基酸组成研究较少，徐丽[30]、段一凡[19]等的研究中母乳氨基酸含量平均值相对本研究较高，如前人研究中早期成熟乳中酪氨酸含量为（43.19±21.10）mg/g，本研究为（33.37±4.97）mg/g，前人研究数据[18,29]波动较大，而本研究氨基酸标准差较小，更加具有代表性。而母乳氨基酸含量平均值的差异可能与多种因素相关，如氨基酸检测方法、样品保存方式等。如表7所示，与FAO标准相比，本研究中0～6 月龄母乳氨基酸模式除精氨酸和半胱氨酸，其余氨基酸含量均小于FAO标准。为进一步探讨各泌乳阶段数据的稳定性，本研究基于不同泌乳阶段母乳氨基酸模式的变异系数分析各泌乳阶段氨基酸组成相对于FAO标准的稳定性。如图3所示，蛋氨酸、甘氨酸、酪氨酸、精氨酸和半胱氨酸变异系数均高于FAO标准，而其他氨基酸含量的变异系数均低于FAO标准，即平均值比FAO标准波动范围小，更具有代表性。

图3 各泌乳时期混合母乳氨基酸变异系数Fig. 3 Amino acid dispersion coefficient of mix breast milk in each lactation period

早期成熟乳和晚期成熟乳阶段南方和北方、冬春季和夏秋季氨基酸模式变异系数如图4所示。北方母乳的蛋氨酸、色氨酸含量的变异系数较大，南方母乳酪氨酸含量的变异系数较大，其余南方母乳的氨基酸含量相对稳定，平均值更加具有代表性（图4A）。早期成熟乳中夏秋季赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、酪氨酸变异系数大于夏秋季，其余氨基酸冬春季更加稳定。晚期成熟乳中，夏秋季母乳的蛋氨酸、色氨酸含量较为不稳定，其余氨基酸含量在冬春季母乳中相对稳定（图4B）。在地域和季节影响下，晚期成熟乳相较于早期成熟乳大部分氨基酸变异系数较小，表明晚期成熟乳混合蛋白质氨基酸含量更加稳定。

图4 不同地域（A）与季节（B）早期成熟乳和晚期成熟乳氨基酸模式变异系数Fig. 4 Discrete coefficient of amino acid model in different regions (A)and season (B)

母乳在婴儿的生长发育阶段具有关键作用，健康的母乳氨基酸模式有利于婴儿的生长发育，母乳营养成分受到多种因素的影响[31]。本研究探讨了地域、产次、分娩方式、出生季度和出生情况对母乳氨基酸模式的影响。通过计算母乳样本间的欧氏平均距离相似度，获取了最小和最大母乳样本，建立了不同泌乳阶段氨基酸模式，提出了不同地域与季节下的母乳氨基酸模式。与FAO标准相比，本研究中母乳氨基酸模式离散程度更低，平均值代表性更强，且南方和北方、冬春季和夏秋季母乳氨基酸模式具有明显差异，未来可以此模式为基础进行动物试验，探讨不同母乳氨基酸模式对于生长发育的影响。本研究为婴配粉的研发提供了参考。