聚乙烯醇-壳聚糖基抑菌指示膜的制备及在冷鲜肉中的应用

吴杨林，孙 理，李亦欣，高 媛，李 昊，郑 聪，李春伟

（东北林业大学工程技术学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

智能包装是指与其他包装相比，可以对包装周围环境进行检测、感知、记录、追踪、交流等的新型包装[1]。活性包装是通过材料中的活性组分来改变食品的包装环境以延长贮存期、改善食品安全性和感官特性，同时保持食品品质不变的一种包装体系[2]。智能包装与活性包装的区别在于智能包装在供应链循环中主要用于监测产品自身或所处环境的信息，而活性包装会主动采取措施（如释放抗氧化剂）来保护产品[3]。冷鲜肉是人们日常饮食中常见的食物原料，但其在贮存期间新鲜度下降货架期较短[4]，容易导致食品安全问题和造成经济损失[5-6]。因此，制备一种既能检测肉类食品新鲜度又能延长食品货架期的智能活性包装具有现实意义。

聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）是一种环境友好型高分子聚合物，具有优良的成膜性、可生物降解性、气体阻隔性及机械强度，在食品包装和医药等领域有着广泛应用[7]。壳聚糖（chitosan，CS）是一种天然高分子，具有良好的生物相容性、成膜性和抗菌性[8]。PVA与CS之间可以形成分子间氢键，CS的添加减少了PVA上羟基与水分子作用，使薄膜的耐水性提高[9]。CS/PVA复合膜相比纯CS膜对氧气和水蒸气的阻隔能力增强、机械性能更优异[10]。大量研究利用合成色素作为指示剂，张星晖等[11]利用溴麝香草酚蓝（bromothymol blue，BTB）制作的指示标签能灵敏地反映金枪鱼的新鲜度。Sutthasupa等[12]以海藻酸钠和甲基纤维素为原料制备水凝胶并加入BTB，检测猪肉糜腐败，腐败过程中指示剂颜色从橙色变为黄色。但研究发现单一指示剂变色范围窄，复配指示剂具有更好的指示效果[13]，Chen Huizhi等[14]发现BTB与甲基红（methyl red，MR）按质量比3∶2混合制备指示剂其颜色变化与猪肉新鲜度具有强相关性。艾月等[15]利用MR和BTB为指示剂制备新鲜度指示水凝胶应用于大米的新鲜度检测，指示材料与新米、陈米、陈化米接触时色圈颜色分别为米绿黄色、象牙色和硫磺色。研究表明，茶多酚（tea polyphenols，TP）可以有效抑制常见微生物的繁殖，具有优异的抗氧化性及广谱抑菌性。李柯欣[16]采用牛津杯法发现TP对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等具有明显的抑菌性。Yang Yufan等[17]发现添加TP的复合膜具有良好的抗氧化和抗菌活性，而且随着TP含量的增加猪肉货架期最多延长了3 d。蒙脱土（montmorillonite，MMT）成本低、稳定性好，在聚合物基质中分散性好，具有独特的二维层状纳米结构和阳离子交换特性，经酸化的MMT具有更强的吸附性和化学活性，是一种优异的中孔载体材料。高灵娟[18]利用改性的MMT成功负载香芹酚和百里香酚，制备的复合材料表现出良好的抑菌性。甘文乐等[19]发现MMT负载TP不仅可以增强PVA薄膜的机械强度，还能够提高薄膜的水蒸气阻隔性、耐水性及抗氧化性能。

因此，本实验以PVA和CS为成膜基材，MMT负载TP为抑菌剂，添加溴甲酚紫（bromocresol purple，BCP）和MR及其复配物（BCP与MR质量比1∶1、1.5∶1、2∶1）作为指示剂制备抑菌指示膜，分别设立空白组，研究抑菌剂和指示剂对PVA-CS薄膜性能的影响，并应用于冷鲜肉的保鲜指示，检验其实际应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CS（脱乙酰度≥90%，分子质量70～80 kDa）上海蓝季生物有限公司；1797型PVA（醇解度96%～98%） 上海阿拉丁试剂有限公司；甘油 天津富宇精细化工有限公司；MTT（120 目，医药级） 山东化学化工科技有限公司；茶多酚（纯度＞98%） 河南万邦实业有限公司；BCP、MR（分析纯） 天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

90-4数显控温磁力搅拌器 上海振捷实验设备有限公司；SB-800D超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；SDH-25055GT台式鼓风干燥箱 上海岛纯实业有限公司；LD-05电脑测控拉力试验机 长春月明小型试验机有限责任公司；WGT-S透光率/雾度测定仪上海仪电物理光学仪器有限公司；SPX-250BIII生化培养箱 天津泰斯特仪器有限公司；X’ Pert3 Powedr X射线衍射仪 荷兰帕纳科公司；Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌指示膜的制备

PVA和CS溶液的制备：称取3 g PVA溶于100 mL蒸馏水中，在95 ℃下水浴搅拌2 h后备用；称取3 g CS溶于100 mL体积分数为1%的乙酸溶液中搅拌至完全溶解。

MMT负载TP溶液的制备：参照周华锋等[20]方法进行MMT酸改性并作适当修改，称取1 g MMT于烧杯中，加入10 mL 1 mol/L HCl溶液搅拌30 min，室温静置24 h后过滤，用去离子水洗涤pH值至6～7，烘干得到酸化的MMT。然后称取1 g酸化MMT和0.5 g TP，加入10 mL无水乙醇，搅拌30 min制得MMT负载TP溶液。

称取BCP和MR及其复配物（BCP与MR质量比1∶1、1.5∶1、2∶1）分别溶于无水乙醇，制备5 g/L指示剂溶液。将制备好的PVA溶液和CS溶液按体积比1∶1混合，加入MMT负载TP溶液（混合膜液总体积的5%），在40 ℃磁力搅拌器中高速搅拌2 h；再加入4 mL指示剂溶液和0.3 mL甘油，放入40 ℃水浴中搅拌1 h，调节pH值至4.5，超声去泡30 min后得到成膜溶液。取120 mL成膜液倒至方形模具（长25 cm）中，室温下放置3 d，揭膜，于25 ℃、相对湿度75%的恒温恒湿箱中密封贮存。

将添加BCP指示剂的薄膜记为X1，添加MR指示剂的薄膜记为X2，将添加BCP与MR质量比1∶1、1.5∶1、2∶1指示剂的薄膜记分别记为X3、X4、X5；以相同方法制备未添加指示剂的PVA-CS/MMT-TP膜作为对照组（记为Y1），研究指示剂对薄膜性能的影响；以相同方法制备未添加抑菌剂的PVA-CS复合膜（BCP与MR质量比1.5∶1）作为对照组（记为Y2），研究抑菌剂对薄膜性能影响。

1.3.2 薄膜的结构表征

1.3.2.1 傅里叶变换红外光谱分析

采用全反射法对样品进行扫描光谱测定，扫描范围4 000～500 cm-1。

1.3.2.2 X射线衍射分析

扫描范围5°～90°，电压40 kV，扫描速率5 °/min。

1.3.3 添加不同指示剂薄膜相关性能的测定

1.3.3.1 薄膜厚度及机械性能

使用精度为0.001 mm的厚度仪在薄膜上随机取5个点测定其厚度。根据GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的测定 第3部分：薄膜和薄片的试验条件》，将薄膜裁成150 mm×10 mm的长条状。参数设定：初始夹距40 mm，拉伸速率10 mm/min。分别按照式（1）、（2）计算拉伸强度和断裂伸长率。

式中：F为拉伸过程最大力/N；S为有效受力面积/mm2；L1为断裂时膜长度/mm；L0为初始膜长度/mm。

1.3.3.2 光学性能

将薄膜裁成50 mm×50 mm，根据GB 2410—2008《透明塑料透光率和雾度的测定》，将样品放入雾度测定仪接收器出射窗口处进行测定。

1.3.3.3 NH3显色灵敏性

分别配制NH3质量分数3%、6%、10%、20%、25%的氨水，对照组为蒸馏水，将待测薄膜裁成1 cm×1 cm的正方形样品，将其排列分布于聚氯乙烯薄膜。用聚氯乙烯薄膜将培养皿覆盖完全（样品置于聚氯乙烯薄膜中心位置）。利用氨水的挥发性，观察薄膜的颜色变化并在标准光源下拍照。利用色差仪进行颜色指标采集。按照公式（3）计算色差值（ΔE）。

式中：L*、a*、b*和分别代表前后两次测定的亮度、红度和黄度。

1.3.4 添加抑菌剂薄膜相关性能的测定

1.3.4.1 含水率以及水蒸气透过率

将55 mm×55 mm的指示膜用电子天平进行称质量并记为m1/g，置于100 ℃鼓风干燥箱中烘干至恒质量后取出试样，称质量记为m2/g。按照式（4）计算薄膜含水率。

取适量蒸馏水倒入50 mL烧杯中，杯口用薄膜包裹并用胶带圈缠绕防止漏气，放入22 ℃恒温干燥箱中。每隔2 h称质量，称量5 次。按照公式（5）计算水蒸气透过率。每种薄膜作3 组平行，结果取平均值。

式中：x为膜厚度/mm；S为有效面积（18.08×10-4m2）；Δm为水分透过的质量/g；t为间隔时间/s；ΔP为膜两边的压强差（3 179 Pa（22 ℃））。

1.3.4.2 耐水性

溶胀率：将样品裁剪成55 mm×55 mm的方形，放置于100 ℃鼓风干燥机中干燥至质量恒定，称量后放入室温蒸馏水中浸泡24 h。取出样品迅速吸干表面水分称质量。每种薄膜作3 组平行，结果取平均值。按式（6）计算溶胀率。

式中：m为薄膜浸泡后的溶胀质量/g；m0为薄膜烘干后的初始质量/g。

溶解质量损失率：将溶胀率测试中吸水溶胀的薄膜置于100 ℃鼓风烘箱中干燥至质量恒定，取出后迅速精确称量薄膜质量，每种薄膜3个平行。溶解质量损失率按式（7）计算。

式中：m2为水溶性物质去除前薄膜质量/g；m1为水溶性物质去除后薄膜质量/g。

1.3.4.3 抗氧化性

参照陈晨伟等[21]的方法并稍作修改，将0.1 g样品剪碎放入50 mL蒸馏水中，95 ℃磁力搅拌器搅拌1 h。取1 mL膜样浸出液，加入3 mL 75 μmol/L 2,2-二苯基-1-苦基肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）溶液，避光处理30 min后利用紫外分光光度计于517 nm波长处测定混合溶液的吸光度。无水乙醇作为空白组，按公式（8）计算DPPH自由基清除率。

式中：A1为待测薄膜样品膜液和自由基溶液的吸光度；A2为无水乙醇和自由基溶液的吸光度；A3为无水乙醇和待测薄膜样品膜液的吸光度。

1.3.5 抑菌性

采用抑菌圈法对薄膜进行抑菌性测试。参照汪志强[21]的方法并稍作修改，选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为实验用菌，先用打孔器制备直径6 mm的薄膜圆片并紫外灭菌2 h，再取400 μL活化后浓度为1×105CFU/mL的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌混合菌液均匀分布于固体培养基表面，然后再用灭菌后的镊子将薄膜圆片置于培养皿中心位置，在37 ℃生化培养箱中培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.3.6 抑菌指示膜在冷鲜肉中的应用实验

将冷鲜猪肉在无菌环境下切成若干份，取（50±1） g猪肉放入锥形瓶中，瓶口用抑菌指示膜覆盖，用保鲜膜加皮筋将四周封紧，于4 ℃冰箱贮存10 d，每2 d测定相关指标。菌落总数：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》；总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量：参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》；pH值：称取5 g样品切碎，加入45 mL蒸馏水，破碎匀浆2 min后静置15 min，用pH计进行测定。贮藏期间记录抑菌指示膜的颜色变化。

1.4 数据处理与分析

使用Origin 9.5软件绘图。采用SPSS软件分析统计数据，对数据进行方差分析以检测数据的显著性，采用Duncan多范围测试比较参数之间的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 指示剂对PVA-CS/MMT-TP薄膜结构的影响

2.1.1 添加不同指示剂PVA-CS/MMT-TP薄膜的傅里叶变换红外光谱

由图1可知，薄膜均出现了相似的特征吸收峰，说明指示剂添加后薄膜结构组分之间未发生化学作用。MMT中含有Al2O3、MgO、SiO2，在1 041、701 cm-1处的振动峰分别对应Si—O、Mg—Fe—OH，这说明薄膜中均存在MMT，这与赵菲[23]的结果类似。3 292 cm-1处为PVA分子—OH伸缩振动的吸收峰[24]，峰形较宽是由于膜中PVA与CS浓度太大，发生缔合作用，形成氢键，这也使得PVA-CS共混膜具有良好的成膜性能、力学性能和氧气阻隔性能[25]。在1 555 cm-1处为C＝C双键伸缩振动，2 906 cm-1处为饱和碳原子上C—H弱吸收振动峰，1 395 cm-1处为甲基基团的对称弯曲振动特征峰，这可能是CS与TP通过接枝共聚形成了共价键，或各组分之间发生氢键等相互作用[26]。在1 200 cm-1附近没有出现吸收峰，表明不存在酚类，可能是因为TP被很好地负载在MMT上。

图1 添加不同指示剂薄膜的傅里叶变换红外光谱Fig. 1 Infrared spectra of films with different indicators

2.1.2 添加不同指示剂的PVA-CS/MMT-TP薄膜的X射线衍射分析结果

由图2可知，Y1在2θ20.3°处出现较弱衍射吸收峰，而研究表明PVA和CS的X射线衍射峰并不重合，这说明PVA和CS之间发生了强烈的氢键结合，并且PVA与CS混合一定程度降低了PVA的结晶度[27]。若共混膜中的指示剂与其他组分分子间未发生或仅有微弱的相互作用，那么共混膜的衍射峰为各组分结晶峰的简单叠加，而本实验中加入指示剂的薄膜在2θ19.8°处出现了较强衍射峰，这表明指示剂与各组分发生了强烈的分子间相互作用（范德华力和氢键），形成了新的交联网状结构，从而增强了共混膜的结晶度[28]。2θ6.18°处出现衍射峰，这可能是酸化后MMT硅酸盐层状结构的形态和层间距有所扩张，TP嵌入到MMT黏层间[29-30]。

图2 不同指示剂薄膜的X射线衍射图Fig. 2 X-ray diffraction spectra of different indicator films

2.2 指示剂对PVA-CS/MMT-TP薄膜理化性能的影响

2.2.1 添加不同指示剂PVA-CS/MMT-TP薄膜的厚度及机械性能

由表1可知，与Y1相比，加入指示剂后薄膜的厚度、拉伸强度和断裂伸长率均显著增大（P＜0.05）。膜厚度与成膜物质密切相关，会直接影响薄膜的机械性能[31]。拉伸强度的增大可能是指示剂的加入使薄膜组分间相容性更好，促进分子间作用力形成更加紧密的氢键网络结构。其中X4的拉伸强度（（56.91±2.16）MPa）最大，相较于Y1提升了13.55%。断裂伸长率反映了材料的柔软性[32]，指示剂的加入降低了薄膜的断裂伸长率，X5的断裂伸长率相较于Y1降低了33.29%，这可能是指示剂与膜基质溶液充分溶合，分子间结构更紧密，使薄膜脆性增加、柔性下降。不同指示剂薄膜中X4断裂伸长率（（36.4±1.23）%）最大。

表1 添加不同指示剂薄膜的厚度和机械性能Table 1 Effect of addition of different indicators on the thickness and mechanical properties of the film

2.2.2 添加不同指示剂PVA-CS/MMT-TP薄膜的光学性能

透光率可用于反映复合膜体系内各成分的相容性，透光率越小、雾度越高，光阻隔性能越强，良好的光阻隔性能可一定程度保护食品免受光照干扰[33]。由图3可知，空白组Y1的透光率最高，为81.84%，X1的透光率最低，为53.74%，且随着BCP、MR复配指示剂中BCP添加量的增加，透光率逐渐降低，雾度相应逐渐增加。空白组薄膜雾度为13.48%，X1雾度最高，为36.52%，相比空白组增加了23.04%。这是由于BCP、MR指示剂本身具有较深的色泽，且BCP较MR颜色更深，因此随着复配指示剂中BCP含量的增加，透光率明显下降，提升了对光的阻隔性能[34]。这与冯永莉等[35]的研究结果一致，指示剂的添加明显改变了指示膜的透光性，显著提高了指示膜对紫外光的阻隔性能。

图3 添加不同指示剂薄膜的透光率和雾度Fig. 3 Transmittance and haze of films with different indicators

2.2.3 添加不同指示剂PVA-CS/MMT-TP薄膜的NH3响应性

由图4可知，随着NH3质量分数的增加，空白组薄膜颜色几乎未发生变化；而薄膜X1颜色变化表现为深紫-紫-紫红；X2表现为黄-淡黄，变化不明显；X3表现为深紫-紫蓝；X4表现为深紫-紫蓝-淡紫；X5表现为深紫-紫-紫红。以上结果可以表明，指示膜对不同质量分数NH3具有响应性。李宁[36]也有类似研究，以麦氏酸活化的呋喃和葡萄皮花青素作为肉类新鲜度指示剂，制备的复合膜对NH3具有响应性，并可以实时监测猪肉的新鲜度。

图4 指示剂薄膜对不同质量分数NH3的响应性Fig. 4 Responsiveness of indicator films to different concentrations of NH3

由图5可知，NH3质量分数为3%时，X4的ΔE最大，为11.653 0，随NH3质量分数增加，X4的ΔE整体呈上升趋势，在NH3质量分数为25%时ΔE为27.946 0，颜色变化明显。X1和X5的ΔE整体均呈先上升后下降趋势，两种薄膜的ΔE均在NH3质量分数为20%时达到最大，分别为27.183 9和23.122 3；X2和X3均在NH3质量分数为3%时，ΔE明显增大，但随NH3质量分数的增加，薄膜颜色变化不明显，这也解释了这两种指示薄膜只有两种显色的原因。无指示剂的Y1 ΔE几乎无变化，这与颜色变化结果一致。以上结果表明，指示膜的颜色变化对挥发出的碱性气体具有积极响应，指示膜用于实时监测食品新鲜度具有潜在可行性。杜月红等[37]以甲基纤维素和聚乙二醇-6000为基材，添加溴甲酚紫、溴百里酚蓝等酸碱指示剂制备指示标签，随着NH3质量分数的增加，6种标签颜色均发生显著变化，具有NH3响应性，可用于冷鲜肉的新鲜度指示。

图5 不同质量分数NH3环境中指示薄膜ΔE的变化Fig. 5 Changes in ΔE of indicator films in response to different concentrations of NH3

2.3 MMT-TP对PVA-CS基智能膜理化性能的影响

2.3.1 添加MMT-TP PVA-CS基智能膜的含水率及水蒸气阻隔性能

由图6可知，未添加MMT负载TP的指示膜Y2含水率高达10.28%，而其他薄膜为6%～9%。这是由于PVA中存在大量羟基，MMT负载TP作用于PVA后形成了氢键，使水分子不易进入分子内部，提高了薄膜的疏水性[38]。X3的水蒸气透过率最小（2.201 0×10-11g/（m·s·Pa）），相较于空白组（5.939 6×10-11g/（m·s·Pa））降低了62.92%。这说明MMT负载TP的加入提高了薄膜的水蒸气阻隔性，这是因为MMT负载TP均匀分散在薄膜中，与各组分的分子间作用力增强，限制了基体分子的运动，从而使水蒸气的通过受到更大阻碍，减少了水蒸气透过量[39]。

图6 薄膜的含水率与水蒸气透过率Fig. 6 Film moisture contents and water vapor transmission coefficients

2.3.2 添加MMT-TP PVA-CS基智能膜的耐水性

由图7可知，空白组薄膜的溶胀率和溶解质量损失率均最高，分别为458.68%和85.71%。而5种抑菌指示膜的溶胀率和溶解质量损失率均较小；这可能是因为MMT负载TP的添加使薄膜分子间结合得更加紧密，减少了膜内游离羟基的数量，这与甘文乐等[19]的研究结果一致，其研究发现纳米MMT负载的TP有效地改善了PVA薄膜的耐水性。TP中含有疏水性苯环基团，增强了薄膜的疏水性，在混合过程中TP与PVA分子间形成氢键，减少了膜内游离分子，限制了水分子与PVA分子中羟基的结合[40]。Wang Yining等[41]采用超声辅助法制备具有良好阻湿性和抗氧化性能的活性PVA-半纤维素/TP薄膜，TP的大量疏水苯环结构为膜材料提供了屏障，PVA-半纤维素/TP薄膜具有较低的水蒸气透过率。

图7 薄膜的溶胀率和溶解质量损失率Fig. 7 Swelling rates and dissolution loss rates of films

2.3.3 添加MMT-TP PVA-CS基智能膜的抗氧化活性

由图8可知，空白组Y2薄膜的DPPH自由基清除率为21.13%。成膜基液中的天然CS具有良好的抗氧化作用。与Y2相比，添加MMT负载TP的5种薄膜的DPPH自由基清除率明显上升，其中X4最高，为54.31%。这是由于水分子进入薄膜后，TP被释放并发挥DPPH自由基清除作用，提高了薄膜的抗氧化活性[42]。Zhang Die等[43]用静电纺丝法制备多功能淀粉/TP纳米纤维膜，研究发现TP赋予薄膜抗氧化活性。Lan Xingzi等[44]采用同轴静电纺丝技术制备芯层负载抗氧化TP和壳层负载抗菌ε-聚赖氨酸的同轴纳米纤维膜，发现薄膜抗氧化活性随着TP含量的增加和在DPPH-乙醇溶液中孵育时间的延长而增强。

图8 薄膜的DPPH自由基清除率Fig. 8 DPPH radical scavenging effect of films

2.3.4 添加MMT-TP PVA-CS基智能膜的抑菌性

由图9可知，空白组Y2抑菌圈微小，直径约为8 mm。这是因为成膜基液中添加了CS，CS对细菌和霉菌均具有抑菌性。郭浩麒等[45]制备的含CS的绿色抗菌膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抑菌性，且随CS添加量的增加，抑菌性增强。添加MMT负载TP的薄膜抑菌圈直径为12～14 mm，与Y2相比，抑菌性更强。这可能是由于MMT负载TP改变了培养基的pH值，破坏了菌种生长繁殖的适宜环境[46]；也可能是因为MMT负载的TP与细菌细胞膜结合，影响了细菌蛋白质的合成，破坏了细胞膜，从而抑制细菌繁殖[47]。Pan Ziqiang等[48]研究发现TP处理可以抑制鱼片中细菌增长，降低鱼片的TVB-N含量，将鱼片货架期延长6 d。Y2薄膜略有卷曲，这是因为PVA富含大量游离羟基的结构特点易造成薄膜耐水性能较差，当薄膜与固体培养基表面的菌液贴合时，水分子进入薄膜并与PVA中的羟基结合，从而出现卷曲现象。此外，Y2还表现出润涨的现象，这是因为PVA分子链中的羟基与水分子接触时会吸水膨胀。但X1～X5薄膜未出现明显的卷曲和润胀现象，这是因为MMT负载TP减少膜内游离分子，限制了水分子与PVA分子中羟基的结合，使薄膜的耐水性增强，这与2.3.2节结果一致。

图9 薄膜的抑菌圈Fig. 9 Zones of inhibition against bacterial strains

2.4 抑菌指示膜在冷鲜肉中的应用

如图10A所示，贮藏初始冷鲜肉的菌落总数为3.34（lg（CFU/g）），且随贮藏时间的延长呈上升趋势；贮藏10 d时Y2组菌落总数为6.27（lg（CFU/g）），超出可食用标准（≤6（lg（CFU/g））），表明此时冷鲜肉已变质。与Y2组相比，X1～X5组的菌落总数上升较缓慢，贮藏10 d时仅X5组菌落总数超出可食用标准，为6.013（lg（CFU/g））。如图10B所示，冷鲜肉的初始TVB-N含量为（6.22±0.67）mg/100 g，贮藏8 d时Y2组的TVB-N含量为（20.22±0.68）mg/100 g，这表明冷鲜肉已腐败（≥20 mg/100 g），而X1～X5组在贮藏10 d时仅X2组的TVB-N含量（（20.22±0.68）mg/100 g）超出限值。如图10C所示，冷鲜肉在贮藏期间pH值均呈上升趋势，初始pH值为5.96，贮藏8 d时Y2组pH值为6.65，此时猪肉临近腐败（pH＞6.7），在贮藏10 d时Y2组pH值为6.81，已完全不能食用，而X1～X5组均低于Y2组，主要原因可能是TP破坏了菌株生长繁殖的适宜环境，影响了细菌蛋白质的合成，从而延缓了冷鲜肉的腐败。综上，抑菌指示膜对冷鲜肉具有保鲜作用，相较于未添加抑菌剂的空白对照组，可以延长冷鲜肉货架期1～2 d。

图10 冷鲜肉4 ℃贮藏期间的鲜度指标变化Fig. 10 Changes in freshness index of chilled pork during4 ℃ storage

图11 抑菌指示膜在冷鲜肉贮藏期间的指示效果Fig. 11 Results of antibacterial indicator films for chilled pork at different storage times

根据猪肉的鲜度标准[49]，将菌落总数、TVB-N含量和pH值这3个化学指标结合，可更全面准确地评价猪肉新鲜度。将X1～X5组冷鲜肉划分为3个等级：0～4 d，新鲜肉；6～8 d，次鲜肉；10 d，腐败肉。Y2组冷鲜肉划分为3个等级：0～2 d，新鲜肉；4～6 d，次鲜肉；8～10 d，腐败肉。如图11所示，抑菌指示膜在冷鲜肉贮藏期间的薄膜颜色均发生了变化。Y2在0～2 d为紫红色，4～6 d 为紫蓝色，8～10 d为紫黑色。X4在冷鲜肉贮藏期间颜色有明显变化，0～4 d为紫红色，6～8 d为紫蓝色，10 d为紫黑色。Y2和X4的指示剂添加为同一配比（BCP与MR质量比1.5∶1），Y2在4 d变为紫蓝色，8 d变为紫黑色，而X4则是6 d变为紫蓝色，10 d时变为紫黑色。这是由于X4组的抑菌指示膜延长了冷鲜肉货架期1～2 d。其他薄膜不能提供冷鲜肉鲜度等级的可靠信息，如X1、X5在4～6 d颜色变化不明显，而此时实验组冷鲜肉的品质已从新鲜肉变为次鲜肉；X2只有两个色度变化，且6～10 d颜色无明显变化，无法指示猪肉新鲜度；X3在8～10 d颜色变化不明显，而此时实验组冷鲜肉已从次鲜肉变为腐败肉。综上可以发现，抑菌指示膜不仅可以延长冷鲜肉货架期1～2 d，而且可以实时监测冷鲜肉的新鲜度。X4的颜色变化与冷鲜肉在相应时间内的新鲜度一致，能较好地指示冷鲜肉的新鲜程度，因此，可将添加BCP与MR质量比1.5∶1的抑菌指示膜在冷鲜肉贮存过程中的颜色变化与新鲜度等级相关联，即紫红色为新鲜肉、紫蓝色为次鲜肉、紫黑色为腐败肉。

3 结 论

以PVA和CS为成膜基材，MMT负载TP为抑菌剂，BCP和MR及其复配为指示剂，制备抑菌指示膜。结构表征表明，各组分之间只是简单的物理结合，通过氢键作用力形成致密的薄膜网络结构；指示剂的添加增强了共混膜的结晶度，改善了薄膜的物理性能和光学性能；指示膜均能对氨气响应。其中BCP与MR质量比1.5∶1薄膜具有最大的拉伸强度（（56.91±2.16）MPa）、断裂伸长率（（36.4±1.23）%），并且具有灵敏的氨气响应性（紫红-紫蓝-淡紫）；BCP薄膜透光率最低（53.74%）、雾度最高（36.52%）。将未添加抑菌剂的PVA/CS复合膜（BCP与MR质量比1.5∶1）作为对照组用于研究抑菌剂对于薄膜相关性能影响，发现添加抑菌剂能够改善薄膜的耐水性、抗氧化性，且具有良好的抑菌性能。将抑菌指示膜应用于冷鲜肉的保鲜及新鲜度指示，结果表明，抑菌指示膜相较于空白组可延长冷鲜肉货架期1～2 d；而且BCP与MR质量比1.5∶1薄膜的颜色变化与冷鲜肉新鲜度等级相一致，即紫红色为新鲜肉、紫蓝色为次鲜肉、紫黑为变质肉。制备的抑菌指示膜不仅具有抑菌保鲜的功能，还可以实时监测冷鲜肉新鲜度，具有应用潜力。今后研究可从薄膜的安全性展开，验证其应用的可行性。