毛细管电泳在生物大分子分析中的应用研究进展

彭 乐 ，程佳伟 ，李淑楠 ，李文龙

（1. 天津中医药大学 中药制药工程学院，天津 300193；2. 省部共建组分中药国家重点实验室，天津 301617）

毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）技术于20世纪60年代首次提出[1]，自20世纪80年代至今发展快速. 与其他色谱技术相比，CE具有分析速度快、分离模式多、样品和试剂消耗少等优点[2-3]，是一种污染后易清洗的环境友好型绿色分析技术[4-5]. 如今，CE已广泛应用于分析化学、生物化学、药物化学、食品科学等众多领域，在复杂样品的分析检测过程中发挥了重大作用，具有广阔的应用前景[6-7]. 自人类基因组计划以来，CE便广泛应用于脱氧核糖核酸（DNA）、蛋白质、多肽等生物大分子的分析. 常用于生物大分子分析的毛细管电泳技术包括毛细管区带电泳、胶束电动毛细管电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦电泳、亲和毛细管电泳以及微流控芯片毛细管电泳等，其基本原理和应用特点如表1所列. 本文就CE在多糖、蛋白质、核酸等生物大分子的分离、结构鉴别、定量方法等方面的研究进行了综述（如图1所示）.

图1 毛细管电泳技术分析生物大分子的示意图Fig. 1 Schematic diagram of analysis of biomacromolecules by capillary electrophoresis

表1 常用于分析生物大分子的毛细管电泳技术的原理及应用特点[8-9]Table 1 Principles and application characteristics of capillary electrophoresis often used to analyze biological macromolecules [8-9]

近年来，很多相关科研工作者越来越多的关注CE在多糖、蛋白质、核酸等生物大分子分析上的应用. 但在样品制备、毛细管内壁吸附、仪器的研制等方面仍存在着一些亟待解决的问题. 本文首先对在分析生物大分子中应用最多的毛细管电泳分离模式的技术原理进行简单介绍，然后对其在生物大分子分析领域的应用报道进行了综述，最后对这类技术的应用前景及其存在的问题进行了总结和展望，以期为相关的研究提供参考，从而推动这类技术在生物大分子分析领域更大范围的推广应用.

1 应用对象

1. 1 多糖

多糖是由10个以上单糖分子通过缩合反应形成的具有复杂空间结构的大分子化合物，是动植物体内最主要的能量来源. 过去人们常将多糖视为非活性成分，近年来随着研究不断深入，发现了上百种多糖具有药效活性，如抗凝、增强免疫力、抗肿瘤等作用，其中香菇多糖、肝素、人参多糖等已被制成相关药物投入临床[10-11]. CE技术主要应用于检测多糖的单糖组成及摩尔比、糖苷键鉴定以及糖类含量测定等方面[12].

Bai等[13]开发了一种快速且高效的胶束动力毛细管色谱（MECC）结合二极管阵列检测器方法，用于确定竹荪多糖样品的单糖组成. 该法在原有文献的基础上测得竹荪多糖样品由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，易于操作、分析时间短、灵敏度高. 林晓燕等[14]采用水提醇沉法从太子参中提取得到粗多糖，经分离纯化后采用CE测定其单糖组成及比例. 谷枫等[15]选取巴戟天粗多糖，酸水解后进行1-苯基-2-甲基-4-吡唑啉酮（PMP）衍生化，随后采用CE分析测定其单糖组成. Snyder等[16]使用CE-MS分离并鉴别了77种血清中的N-聚糖，其中31个N-聚糖结构在先前的研究中未被发现. 此外，采用了芯片电泳和毛细管电泳技术结合选择性电荷中和法，此法通过甲基酰胺化中和唾液酸对N-聚糖的电荷，但吗啉盐酸盐（DMT-MM）在氯化铵条件下选择性酰胺化α-2, 6键，未处理条件下形成α-2, 3键，对α-2, 3和α-2, 6键异构体进行分离. 此法可鉴别不同糖苷键化合物，并可以通过质谱进一步确定其结构. 谭惠文等[17]采用水提醇沉的方法从德国洋甘菊和罗马洋甘菊中得到多糖，再经三氟乙酸（TFA）水解，PMP衍生化，最后使用CE对两种洋甘菊多糖中单糖组分的摩尔比进行测定，结果表明德国洋甘菊和罗马洋甘菊的多糖组成分别为半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖. 周艳[18]采用CE测定猴头菌及其多糖水解物中单糖组成及比例. 优化分离条件：电动进样10 s，以35 mmol/L硼砂缓冲液为电泳介质，分离电压为20 kV. 测得猴头菌多糖水解液中含有3种单糖，包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖. 该方法快速准确、重现性较好，可用于中药糖类组分的分析检测.

1. 2 蛋白质

蛋白质在生物体中执行着大量的生物学功能，蛋白质的结构和功能通常都是通过其酶产生的肽片段来识别的[19]. 在蛋白质组学研究中，常使用一种自下而上的方法，即通过消化成肽间接鉴定蛋白质[20-21]. CE技术是蛋白质组学的主要分析技术之一，广泛应用于多肽的检测，蛋白质的分离、定量、结构分析及活性检测等方面.

王洋洋等[22]在建立并优化双水相法分离纯化鳜鱼蛋白的基础上，采用高效毛细管胶束电动色谱（MECC）耦合二极管阵列检测器（DAD）检测鳜鱼肌动蛋白的含量，背景电解质为四硼酸钠-十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲溶液. 结果显示肌动蛋白在10 min左右时出峰，谱图基线平稳无杂峰，重复性良好，为海洋药物蛋白的定量检测提供参考. 李振庆等[23]采用脉冲电场毛细管电泳（PFCE）对溶菌酶、生长激素、碳酸酐酶、肌动蛋白、牛血清白蛋白和磷酸化酶B进行测定. 结果表明，相比于直流电场毛细管电泳（DCCE），相同蛋白质分子的分离时间更短，分离度更高. Zhang等[24]报道了一种基于迁移率毛细管电泳（MCE）快速分析蛋白质立体结构和有效电荷的方法. 通过对5种蛋白质在接近自然环境下的电荷态和结构的分析，以及不同pH条件下牛血清白蛋白和溶菌酶的构象转变和电荷态变化的研究，证明了该法的可行性. He等[25]利用毛细管电泳-质谱（MCE-MS）技术完成了溶菌酶的三维结构分析，并对MCE-MS技术分析复杂基质中微量的生物分子进行了研究，证明了该法是一种功能强大的生物分子结构分析技术. Deyanova等[26]开发了一种快速而强大的微流控芯片毛细管电泳-质谱（CEMCMS）方法，用于识别具有复杂的唾液化N和O链糖型的治疗性融合蛋白的完整糖基化指纹. 该方法能有效地分离多种唾液化糖型，并能在6 min内快速检测糖基化谱的变化. 李悦[27]将毛细管电泳和固定化酶技术结合用于组蛋白去乙酰化酶（HDACs）抑制剂的在线活性筛选. 在优化分离条件后，结果显示测得的酶促反应动力学与抑制剂动力学结果与文献报道一致. 此法稳定性高、重复性好、操作简单高效、消耗物料量小且具有较高的自动性，有望成为组蛋白去乙酰化酶抑制剂研发的重要手段.

1. 3 核酸

核酸是生物遗传信息载体，包括DNA与RNA，是由多个核苷酸单体聚合而成的长链，经盘曲折叠形成多级结构. 核酸适配体是RNA或短的单链DNA（ssDNA）分子，可与某些目标物如金属离子、蛋白质等特异性结合. 适配体具有体积小、重复性高、维持可逆变性能力强、容易和可控的修饰以及缺乏免疫原性等优点，作为抗体替代品具有巨大的潜力[28]. 目前CE是分析核酸的重要工具，主要在核酸适配体的表征、核酸的分离检测及核苷酸的测定等方面得到了广泛应用.

蔡先洪等[29]采用毛细管电泳法-指数富集配体系统（CE-SELEX）对维吉霉素M1适配体进行筛选分析，并测定了其中亲和力最大以及特异性最强的适配体的平衡常数（Kd）. Wang等[30]利用荧光耦合毛细管电泳法研究了凝血酶与其G-四链适配体的动态结合状态及其相互作用对的稳定性. Yu等[31]首次建立了毛细管电泳串联质谱法同时测定8种RNA修饰核苷酸的方法，并进一步研究了Ni2+对RNA表观遗传学的影响. Lu等[32]建立了高分辨CGE分离大分子RNA的方法. 该方法使用了非水凝胶，相较于标准的水性凝胶，对大分子RNA的分辨率提高了6倍. Demelenne等[33]采用亲水液相色谱（HILIC）和毛细管区带电泳-紫外（CZE-UV）法分析脱氧（胸腺）核酸（dT）和经修饰的硫代寡核苷酸（PS），比较了HILIC法和CZE法在选择性、分离度、重复性等方面的差异，并将HILIC和CZE与漂移管离子迁移四极飞行时间质谱仪（DTIMSQTOF）耦合，检测PS中核苷酸的数量. Wei等[34]开发了一种基于分离辅助双循环信号扩增策略的超灵敏CEMC方法，用于检测细胞裂解液中的microRNA（miRNA）. 该方法以最高灵敏度对微量miRNA进行了检测，在生物医学研究和临床诊断中具有巨大的潜力. 张丽霞等[35]采用CGE结合荧光检测器的方法来分离质粒DNA，该方法能很好地将质粒DNA超螺旋、线性及开环三种构象分开，是一种灵敏度高，可重复性好的分析方法.

1. 4 脂质

脂质也是能量的储存形式，是细胞膜的重要结构成分，可以分为简单脂质、复合脂质以及衍生脂质，而CE主要在衍生脂质中的应用较多.

胡月芳[36]建立了毛细管电泳-电化学检测（CEED）方法，对淮山中3种植物甾醇（麦角甾醇、胆甾醇、β-谷甾醇）进行了含量测定. 结果表明，在优化条件下，3种植物甾醇在10 min内实现了基线分离.该方法是测定淮山中植物甾醇类成分的一种简单可靠、准确、有效的方法. Zhou等[37]报道了一种基于柱上酶促法和激光诱导荧光检测的毛细管电泳方法，用于测定血浆中的总胆固醇含量. 在这个方法中，毛细管不仅作为分离介质，而且还可以作为反应室，以减少样品数量和试剂消耗. 同时整个过程都可以实现自动化，从而使可能出现的误差最小化，并节省了试验时间. 最终试验结果表明，所建立的方法足以定量血浆中的总胆固醇. Du等[38]利用毛细管电泳结合二极管阵列检测器对人类尿液中的睾酮/表皮睾酮浓度比进行了测定，最佳分离条件：压力进样10 s，以15 mmol/L 醋酸-醋酸钠溶液为电泳介质，分离电压为20 kV. 方法考察表明，所建立的方法能够简单、灵敏、经济、准确地测定人尿液中睾酮与表皮睾酮的比例. Geda等[39]采用毛细管电泳紫外吸收检测方法对大鼠大脑和小脑中的5种神经节苷脂进行了测定. 通过方法学考察，该方法的适用性得到了证明，可用于研究神经节苷脂组成在各种病理条件下的变化以及对不同药物治疗的反应. Barakat等[40]建立了一种采用环糊精修饰的CZE方法研究脂质寡核苷酸（LONs）的组成，同时采用ACE来确定LONs的结合常数. 该方法成功研究了LONs的组成. 表2总结了近年来毛细管电泳技术在一些生物大分子中的应用实例.

表2 毛细管电泳技术在生物大分子分析中的应用Table 2 Application of capillary electrophoresis in analysis of biological macromolecules

2 总结与展望

虽然利用CE技术分析生物大分子的应用很多，但在分析的过程中仍会遇到一些难题. 例如，多数多糖类化合物是电中性的，没有紫外或荧光发射基团，且分子量巨大也不易用质谱检测，所以一般要对其进行预处理，如衍生化，使其变成带有电荷且具有一定紫外吸收或荧光发色基团的物质. 然而，一般的衍生化步骤比较复杂，同时衍生化试剂也是有害且不环保，所以针对这一问题，有待寻找一些简单且环保的衍生化步骤，或采用一些非衍生化的方法来检测，如电化学检测法. 电化学检测法灵敏度高，操作简便，适用于糖类化合物的测定.

对于一些碱性大分子，如碱性蛋白质，在采用CZE分析时，由于毛细管内壁表面的硅羟基在pH大于3时会发生电离形成带负电的吸附点，使管壁对碱性蛋白质产生强烈的吸附，从而导致分离效率下降，所以克服吸附是分析蛋白质样品的首要任务.目前最常见的减少蛋白质吸附的方法包括改变缓冲溶液的性质或惰化毛细管内壁. 但惰化毛细管内壁比较复杂，所以主要的办法还是在缓冲液中加入添加剂，通过改变毛细管壁的状态以及样品的性质来抑制蛋白质的吸附. 近年来发展起来的离子液体（lonic liquids, ILs）和 低 共 熔 溶 剂（deep eutectic solvents, DES）有望成为一种有效的添加剂来减少蛋白质的吸附作用.

CE技术在分离生物大分子方面已经表现出巨大的潜力，但是定性分析仍然存在难题. 毛细管电泳与质谱仪的结合为定性问题提供了有力的手段，非常适合蛋白质、肽等生物大分子的分析. 毛细管电泳和电喷雾质谱结合是最为常见的分析方法之一，但其仍然存在一些缺点，如电接触不稳定，所以需要研发更多的仪器来弥补这些缺陷，毛细管电泳基质辅助激光解吸电离质谱、毛细管电泳感应耦合等离子体质谱等可以弥补这个缺陷.