基于熵权法和灰色关联度分析法的夏枯草质量评价Δ

李国超，卢慧娟，姬生国（广东药科大学中药学院，广州 510006）

夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的干燥果穗，以其夏季果穗呈棕红色时采收，除去杂质，晒干入药，该药材性寒、味辛、苦，归肝、胆经，具有清肝明目、消肿散结的功效[1]，临床常用于治疗甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎、高血压等症[2-3]。夏枯草现收载于2020年版《中国药典》（一部），以迷迭香酸为指标成分[1]。现代研究表明，夏枯草主要含有黄酮类、酚酸类、三萜类、甾体类等化合物，具有降血压、降血糖、抗菌、抗病毒、抗炎和抗肿瘤等活性[3-4]。其中黄酮类化合物为夏枯草的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、调节免疫及保护心血管等药理作用[5]，与夏枯草药理作用有较大关联性。目前夏枯草的质量研究主要为传统生药学鉴别[6]、指纹图谱[7]等，但传统生药学鉴别的主观影响较大，干扰因素较多；指纹图谱只能从化学成分方面进行考察，无法全面、综合地评价夏枯草质量。基于此，本研究以10个产地的117批夏枯草饮片为研究对象，以迷迭香酸、水分、水溶性浸出物及总黄酮含量为评价指标，采用熵权法计算权重，同时结合灰色关联度分析法计算关联度，旨在为全面、客观评价夏枯草的质量提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有1120型高效液相色谱仪、BIY211b型电子天平、AY120型十万分之一天平（日本Shimadzu公司），LK-400型手提式高速中药粉碎机（温岭市创力药材器械厂），KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UV-1800 型紫外分光光度计（北京北分瑞利分析仪器公司），SHB-Ⅲ型循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

迷迭香酸对照品（批号14020115，纯度≥98%）、芦丁对照品（批号12040302，纯度≥98%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。

117批夏枯草饮片于2019年6月购自江苏南京、安徽亳州、河南新乡等10个产地，经广东药科大学中药学院姬生国教授鉴定为唇形科植物夏枯草P. vulgarisL.的干燥果穗。样品经干燥后粉碎，过24 目筛，保存于自封袋中，置于干燥器中备用。夏枯草饮片的信息来源见表1。

表1 夏枯草饮片的信息来源

2 方法与结果

2.1 迷迭香酸的含量测定

2.1.1 色谱条件 以ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）为色谱柱，以甲醇-0.1%三氟乙酸溶液（42∶58，V/V）为流动相；流速为0.6 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为330 nm；进样量为5 µL。

2.1.2 对照品溶液的制备 取迷迭香酸对照品5.09 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成迷迭香酸质量浓度为0.509 0 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取样品0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，超声（功率90 W，频率59 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 系统适用性试验 取上述对照品溶液、供试品溶液及空白溶液（稀乙醇），按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1，空白图略）。结果显示，迷迭香酸峰形稳定，与供试品中的其他色谱峰达到基线分离，理论板数为17 718。

图1 供试品溶液、迷迭香酸对照品溶液的HPLC图

2.1.5 线性关系考察 取“2.1.2”项下对照品溶液1.0、1.0、1.0、2.0、1.0、1.0、1.0 mL，分别置于2、5、10、25、25、50、100 mL容量瓶中，用稀乙醇定容，摇匀，得系列线性溶液。取上述系列线性溶液及对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。结果显示，迷迭香酸的回归方程为Y=2×107X-65 910（r=0.999 9），表明迷迭香酸的检测质量浓度在0.005 09～0.509 0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.6 方法学考察 （1）精密度试验：取“2.1.2”项下对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，迷迭香酸峰面积的RSD为0.27%（n=6），表明仪器精密度良好。（2）稳定性试验：取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S93），于室温下放置0、2、4、6、12、24 h时，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，迷迭香酸峰面积的RSD为2.6%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。（3）重复性试验：取样品（编号S93）0.25 g，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算迷迭香酸的含量。结果显示，迷迭香酸含量的RSD为0.80%（n=6），表明方法的重复性良好。（4）加样回收率试验：精密称取已知含量的样品（编号S93，迷迭香酸含量为0.504 6%）0.1 g，共6份，分别精密加入对照品0.5 mg，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，迷迭香酸的平均加样回收率为100.14%（RSD=0.48%，n=6），表明方法的准确度良好。

2.1.7 样品中迷迭香酸含量测定 取117批样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1” 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算含量。每批样品平行测定2次。结果见表2。

表2 迷迭香酸、总黄酮、水分和水溶性浸出物含量的测定结果（n＝2，%%）

2.2 总黄酮的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定芦丁对照品4.970 0 mg，用50%乙醇溶解并定容，制得芦丁质量浓度为0.198 8 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定样品粉末0.5 g，精密加入50%乙醇15 mL，超声（功率300 W，40 KHz）提取75 min，滤过，即得。

2.2.3 检测波长的选择 精密移取上述对照品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入1% AlCl3溶液3 mL、醋酸钠-冰醋酸缓冲液1 mL，然后用50%乙醇定容，摇匀，于40 ℃恒温水浴加热10 min；取上述供试品溶液同法操作。以50% 乙醇为空白对照，在250～800 nm波长范围内扫描，结果显示，对照品和供试品溶液均在285 nm波长处有最大吸收，故选择检测波长为285 nm（图略）。

2.2.4 线性关系考察 精密量取上述对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，按“2.2.3”项下方法显色后，于285 nm波长处测定吸光度，以质量浓度为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）进行线性回归。结果显示，芦丁的回归方程为Y=17.051 0X+0.041 4（r=0.999 8），表明芦丁的检测质量浓度在0.009 9～0.079 5 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5 方法学考察 （1）精密度试验：取“2.2.2”项下供试品溶液（编号S104），按“2.2.3”项下方法显色后，于285 nm波长处连续测定6次吸光度。结果显示，吸光度的RSD为0.05%（n=6），表明方法精密度良好。（2）稳定性试验：取“2.2.2”项下供试品溶液（编号S104），按“2.2.3”项下方法显色后，在室温下静置0、30、60、90、120、180 min时，于285 nm波长处测定吸光度。结果显示，吸光度的RSD为1.90%（n=6），表明样品在室温下放置180 min内稳定性良好。（3）重复性试验：取“2.2.2”项下供试品溶液（编号S104），按“2.2.3”项下方法显色后，于285 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算样品含量。结果显示，总黄酮含量的RSD为2.38%（n=6），表明方法重复性良好。（4）加样回收率试验：取已知含量的样品（编号S104，总黄酮含量为4.133 1%），共6份，每份1 g，精密称定，加入芦丁对照品4.1 mg，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.3”项下方法显色后，于285 nm波长处测定吸光度并计算加样回收率。结果显示，芦丁的平均加样回收率为99.49%（RSD=1.03%，n=6），表明方法的准确度良好。

2.2.6 样品中总黄酮含量测定 取117批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.3”项下方法显色后，于285 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算含量。每批样品平行测定2次。结果见表2。

2.3 水分含量测定

按2020年版《中国药典》（四部）通则“0832水分测定法”项下第二法“烘干法”测定水分含量[8]。每批样品平行测定2次。结果见表2。

2.4 水溶性浸出物含量测定

按2020年版《中国药典》（四部）通则“2201浸出物测定法”项下水溶性浸出物测定法中的“热浸法”测定水溶性浸出物含量[8]。每批样品平行测定2次。结果见表2。

2.5 熵权法计算各指标权重

设有m个样品，每个样品有n项评价指标，由此组成单元序列{Xij}（i=1、2、3……m；j=1、2、3……n；本研究中n=4，m=117）。由于各指标间量纲不统一，需对原始数据进行标准化处理。如果评价指标为正向指标，则采用公式（1）进行标准化处理；如果指标为负向指标，则采用公式（2）进行标准化处理。Yij为标准化处理后的数据，Xij为第i个样品的第j个指标值。

根据信息论中信息熵的定义，按公式（3）、（4）计算各个指标的信息熵（E），Ej为样品第j个指标的信息熵，若Pij=0，则定义lnPij=0；再按公式（5）计算各指标的权重（W）j[9-10]。结果见表3。

表3 各指标的信息熵及权重结果

2.6 灰色关联度分析法计算各指标的相对关联度

2.6.1 无量纲化处理 在灰色关联度分析中，首先确定评价单元序列：设有m个样品，每个样品有n项评价指标，由此组成单元序列{Xik}（i=1、2、3……m；k=1、2、3……n）。多指标评价中因各指标单位、量级不同，无法进行直接评价，故需对原始数据进行无量纲化处理，计算公式为Yik=Xik/Xk，Yik为处理后的数据，{Xik}为原始数据，{Xk}为样品第k个指标的平均值[10]。

2.6.2 相对关联度的计算 迷迭香酸、总黄酮、水溶性浸出物含量为正向指标，关联系数按公式（6）计算（n=3，m=117，ρ为“2.5”中熵权法计算所得的权重）；水分含量为负向指标，关联系数按公式（7）计算（n=1，m=117，ρ为“2.5”中熵权法计算所得的权重）；再按公式（8）计算相对关联度（r）i[11]。结果见表4。

表4 117批夏枯草的相对关联度及排序结果

续表4

3 讨论

2020年版《中国药典》仅以迷迭香酸为夏枯草质量控制的唯一活性指标[1]。但由于中药成分复杂，其药效的发挥往往是多个成分协同作用的结果，因此采用多指标评价的方法能更加全面表征药材的质量[12]。有研究发现，夏枯草中所含有的总黄酮具有抗肿瘤、抑菌、降血脂等活性[5]，与夏枯草的药理作用关联度大，此外药材中的水分与水溶性浸出物含量可从药材储藏期、霉变、虫蛀等方面影响药材的质量[13-14]，因此本研究选择迷迭香酸、总黄酮、水分及水溶性浸出物作为夏枯草的指标成分。含量测定结果显示，从迷迭香酸、总黄酮和水溶性浸出物含量来看，以江苏南京（S16～S25）、安徽亳州（S63～S88）等产地药材的含量较高（质量较优）；从水分含量来看，以湖北随州（S89～S97）、河南南阳（S54～S62）等产地药材的含量较低（质量较优）。不同指标的含量测定结果存在差异，因此多指标综合评价夏枯草质量更加科学。

本研究通过熵权法对迷迭香酸等4个指标进行客观赋权，再根据各指标的权重计算相对关联度，有效避免了因主观判断误差对权重分配的影响。熵权法分析结果显示，迷迭香酸、总黄酮、水分、水溶性浸出物含量的权重分别为0.297 1、0.277 5、0.163 7、0.261 6，以迷迭香酸含量的权重最大，表明其对夏枯草药材的质量影响最大。总黄酮含量权重排名第2位，提示总黄酮含量也是影响夏枯草药材质量的重要指标。相对关联度结果显示，最大值为0.616 3，最小值为0.159 3，表明不同批次的药材质量存在差异，其中S16～S24批药材质量排名靠前，提示江苏南京产夏枯草质量较优。

综上所述，以迷迭香酸、总黄酮、水分及水溶性浸出物含量为评价指标，采用熵权法和灰色关联度分析法可用于夏枯草的质量评价；不同批次夏枯草质量存在差异，以江苏南京产夏枯草质量最优。