PELGE-克班宁纳米粒在大鼠体内的组织分布及药动学研究Δ

崔利利，孔淑君，王辉黄秋艳汪红梅马云淑（.云南中医药大学中药学院，昆明 6000；2.南京中医药大学药学院，南京 2002；.迪沙药业集团有限公司，山东 威海 264200；4.云南省高校外用给药系统与制剂技术重点实验室，昆明 6000；.云南省傣医药与彝医药重点实验室，昆明 6000）

克班宁[crebanine（Cre），化学结构式见图1]是从防己科千金藤属云南地不容Stephania yunnanensisH. S.Lo中提取的生物碱[1]，具有抗炎、抗心律失常、抗肿瘤作用，临床价值较高[2-9]。但有研究表明，Cre的半数致死量（median lethal dose，LD50）为9.382 mg/kg，毒性较大，使得其研发和应用受到了限制[6]。聚乙二醇-（聚乳酸-羟基乙酸）-聚乙二醇三嵌段共聚物[polyethylene glycolpoly lactide（acid-hydroxyacetic acid）-poly ethylene glycol triblock copolymer），PELGE]的生物相容性较好，可延长药物在血液中的循环时间，并缩短其代谢时间[10-11]，故本课题组前期制备了以PELGE为载体的Cre纳米粒（PELGE-Cre-NPs）。相关药动学研究结果显示，与Cre注射液相比，PELGE-Cre-NPs在家兔体内的滞留时间显著延长[12]。有研究指出，药物在不同生物体内存在质或量的种属差异[13]。基于此，本研究拟进一步探讨PELGE-Cre-NPs在大鼠体内的组织分布情况及组织药动学特征，以期为该制剂后续的药效学研究提供理论基础支撑。

图1 Cre的化学结构式

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括1260 Infinity型高效液相色谱（HPLC）仪（美国Agilent公司）、HSC-12A型氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）、XHF-1型内切式匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、TGL-16G型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、XK96-A型快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

PELGE-Cre-NPs（批号 2016011003，Cre含量 1.5 mg/mL，包封率90.32%）、Cre对照品（批号20141101，纯度99.2%）均由云南中医药大学药剂实验室自制（制备方法参考文献[14]）；盐酸维拉帕米对照品（内标，批号100223-200102，供含量测定用）购自中国食品药品检定研究院；氯化钠注射液（批号2106304B，规格500 mL∶4.5 g）购自安徽双鹤药业有限责任公司，作生理盐水用；75%乙醇（批号121002）购自昆明远方生物制品有限公司；甲醇为色谱纯，乙酸乙酯等其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠54只，雌雄各半，体质量180～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号为SCXK（湘）2019-0004。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取Cre对照品适量，用甲醇溶解制成质量浓度为1 000 μg/mL的储备液，再用甲醇进一步稀释制成质量浓度为 520、260、130、65、32.5、16.25、8.125 μg/mL的系列标准溶液，于4 ℃条件下保存，备用。

2.1.2 内标溶液 精密称取内标2 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度为200 μg/mL的内标溶液，于4 ℃条件下保存，备用。

2.2 生物样品处理方法

取大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑组织样品各适量，精密称定，分别加生理盐水少许，用组织匀浆机以5 000 r/min匀浆，再加生理盐水，制成每3 mL含1 g组织的样品。精密吸取上述组织样品0.5 mL，置于离心管中，精密加入“2.1.2”项下内标溶液20 μL、甲醇20 μL、乙酸乙酯3 mL，涡旋萃取3 min，再以4 000 r/min离心10 min，吸取上层有机相2.4 mL，置于5 mL离心管中，于50 ℃水浴中以氮气流吹干，残渣加甲醇200 μL，涡旋1.5 min复溶，经0.22 μm滤膜滤过，取续滤液20 μL进行HPLC分析。

2.3 样品分析方法的建立与验证

2.3.1 色谱条件 以Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，甲醇-0.01%三乙胺溶液（75∶25，V/V）为流动相；流速为1 mL/min；检测波长为280 nm；柱温为30 ℃；进样量为20 μL。

2.3.2 方法学考察 （1）专属性考察：分别取未给药大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑组织适量，除不加Cre对照品和内标溶液外，其余按“2.2”项下方法处理后，制成空白组织匀浆液，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，得大鼠空白组织样品色谱图（图略）；将一定量的Cre对照品溶液（5 μg/mL）加入空白组织匀浆液中，按“2.2”项下方法处理后，再按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，得含对照品和内标空白组织样品的色谱图（图2A）；尾静脉给药后5 min处死大鼠，取各组织并制备得含药的心、肝、脾、肺、肾、脑组织匀浆液样品，按“2.2”项下方法处理后，再按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，得含药组织样品的色谱图（图2B）。由图2可知，大鼠各组织中的内源性物质对Cre和内标的测定无干扰。

图2 Cre专属性考察的HPLC图

（2）标准曲线绘制与定量下限考察：精密量取大鼠空白心、肝、脾、肺、肾、脑组织匀浆液0.5 mL，置于10 mL离心管中，分别加入“2.1.1”项下Cre系列标准溶液适量，制成 Cre质量浓度分别为 0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 μg/mL的系列心组织样品，质量浓度分别为0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的系列肺组织样品和质量浓度均分别为0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/mL的系列肝、脾、肾、脑组织样品。取上述系列组织样品，按“2.2”项下方法处理后，再按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以Cre质量浓度为横坐标（c）、Cre与内标的峰面积比值为纵坐标（A）进行线性回归，结果见表1。由表1可见，各组织样品中，Cre在各自检测质量浓度范围内与峰面积比值的线性关系均良好（R2＞0.999），定量下限质量浓度均为0.312 5 μg/mL。

表1 大鼠各组织样品中Cre的回归方程和线性范围

（3）精密度与准确度试验：分别于同日内6个不同时间点和3 d内按“2.3.2（2）”项下方法配制Cre低、中、高质量浓度和定量下限质量浓度的心、肝、脾、肺、肾、脑组织样品，按“2.2”项下方法处理后，再按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，以RSD考察日内、日间精密度，以实测质量浓度与理论质量浓度的比值考察准确度，结果见表2。由表2可知，Cre各组织样品的日内、日间RSD均小于10%，准确度为81.85%～118.83%。

（4）稳定性试验：分别按“2.3.2（2）”项下方法配制Cre低、中、高质量浓度的各组织样品，按“2.2”项下方法处理后，分别于室温放置24 h、-20 ℃放置24 h、反复冻融（-20 ℃～室温）3次后，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果显示，各样品中Cre峰面积的RSD均小于10%，符合生物样品方法学考察的相关要求[15]。

2.4 PELGE-Cre-NPs在大鼠各组织样品中的分布情况

将大鼠分为9组（每个时间点为1组），每组6只，雌雄各半。大鼠禁食、不禁水24 h后，以5 mg/kg的剂量（以Cre质量计，剂量设置参考文献[16]）尾静脉注射PELGE-Cre-NPs，随后分别于5、15、30、60、90、120、180、240、300 min时解剖大鼠，取心、肝、脾、肺、肾、大脑组织样品，用生理盐水清洗表面，以滤纸吸干后，按“2.2”项下方法处理后，再按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，以内标法计算各组织样品中Cre的含量。大鼠尾静脉注射PELGE-Cre-NPs后各时间点心、肝、脾、肺、肾、脑组织样品中Cre含量的变化情况见图3。由图3可知，给药后5、15、30、60、90 min，Cre在大鼠各组织样品中的含量由高到低依次为肺、肾、脾、肝、脑、心；给药后120、180、240、300 min，Cre在大鼠各组织样品中的含量由高到低则变为肺、脾、肾、肝、脑、心。与本课题组前期研究[17]的Cre注射剂相比，PELGE-Cre-NPs在大鼠各组织中的分布明显增加，代谢时间有所延长，初步达到了长循环的目的。

图3 尾静脉注射PELGE-Cre-NPs后不同时间点大鼠各组织样品中Cre含量的变化情况

2.5 PELGE-Cre-NPs在大鼠各组织样品中的药动学特征

使用DAS药动学软件对大鼠各组织样品中Cre的浓度数据进行非房室模型拟合，大鼠6个组织的平均药-时曲线见图4，主要药动学参数见表3。以药-时曲线下面积（AUC0-t）为Cre组织分布的评价指标[18]，结果显示，Cre在大鼠各组织样品中的分布由高到低依次为肺、肾、脾、肝、脑、心；以平均滞留时间（MRT0-t）为Cre滞留的评价指标，结果显示，Cre在大鼠各组织样品中滞留时间由长到短依次为脾、肝、心、肺、肾、脑；此外，Cre在心、肝、脾、肺、肾、脑组织中的末端消除半衰期（t1/2z）分别为4.83、5.93、3.75、4.99、3.89、3.95 h。

图4 尾静脉注射PELGE-Cre-NPs后大鼠各组织样品中Cre的平均药-时曲线（±s，n＝6）

表3 尾静脉注射PELGE-Cre-NPs后大鼠各组织样品中Cre的主要药动学参数（非房室模型，±s，n＝6）

表3 尾静脉注射PELGE-Cre-NPs后大鼠各组织样品中Cre的主要药动学参数（非房室模型，±s，n＝6）

AUMC0-t：药物与时间乘积对时间t的积分；VRT0-t：滞留时间的方差；Vz：分布容积；CLz：清除率；cmax：达峰浓度

参数AUC0-t/（mg·h/L）AUMC0-t/（mg·h2/L）MRT0-t/h VRT0-t/h2 t1/2z/h Vz/L CLz/（L/h）cmax/（μg/g）心肝脾肺肾脑18.86±1.66 36.53±1.24 1.94±0.12 2.18±0.05 4.83±1.98 1.02±0.23 0.15±0.06 8.47±2.43 43.36±4.99 85.27±3.06 1.97±1.02 2.17±0.07 5.93±2.34 0.47±0.08 0.06±0.02 21.81±5.56 51.36±5.34 101.84±3.87 1.98±1.23 2.10±0.05 3.75±1.87 0.33±0.07 0.06±0.02 22.05±6.75 81.86±12.34 154.80±6.55 1.89±0.21 2.25±0.07 4.99±2.54 0.24±0.06 0.03±0.01 48.16±13.98 53.31±3.19 100.04±2.06 1.88±0.06 2.10±0.03 3.89±1.05 0.33±0.04 0.06±0.01 29.19±5.64 27.73±4.76 51.28±3.23 1.85±0.19 2.21±0.09 3.95±2.67 0.64±0.15 0.11±0.03 17.94±6.12

3 讨论

组织分布实验结果显示，尾静脉注射PELGE-Cre-NPs后，Cre在大鼠体内的各个组织中均有分布：给药后5、15、30、60、90 min，Cre在大鼠各组织中的含量由高到低依次为肺、肾、脾、肝、脑、心；给药后120、180、240、300 min，Cre在大鼠各组织中的含量由高到低则变为肺、脾、肾、肝、脑、心。此外，随着时间的推移，大鼠各组织样品中Cre的含量皆在下降，且不同组织间Cre含量的差异有缩小趋势。

组织药动学研究结果显示，Cre在肺组织中的AUC0-t最大[（81.86±12.34）mg·h/L]，t1/2z较长[（4.99±2.54）h]，提示PELGE-Cre-NPs在大鼠肺组织中的分布较多且消除较慢。Cre在肝组织中的AUC0-t居中[（43.36±4.99）mg·h/L]，t1/2z最长[（5.93±2.34）h]，MRT0-t也较长[（1.97±0.12）h]，提示PELGE-Cre-NPs在大鼠肝组织中也有一定分布，且消除时间较长。Cre在心组织中的AUC0-t最小[（18.86±1.66）mg·h/L]，但其MRT0-t[（1.94±0.12）h]长于该药在肺组织中的MRT0-t[（1.89±0.21）h]，提示PELGE-Cre-NPs虽在心组织中的分布较少，但滞留时间较长。Cre在脑组织中亦有所分布，提示该药能透过血脑屏障，这可能与Cre为弱碱性的小极性化合物有关。

通过对比本课题组前期组织分布研究[17]结果发现，与Cre注射剂相比，制成PELGE-Cre-NPs后，Cre在心、肝、脾、肺、肾、脑组织中的平均含量（给药后120 min）分别由 1.39、1.66、1.56、2.53、1.56、1.42 μg/g 升至 3.37、7.82、10.11、14.11、9.82、4.93 μg/g，提示剂型的改变使Cre在大鼠各组织中的分布均有所增加，初步达到了长循环的目的。但由于2项实验的操作条件有所不同，故剂型的分布差异有待后续研究进一步验证。

综上所述，PELGE-Cre-NPs在大鼠各组织中均有分布，以肺组织为主，心组织较少；该药在各组织中的消除有所不同，在心、肺、肝组织中的消除较慢。