中性粒细胞外捕网在胃癌病人术后高凝状态形成中的作用

杨春发，刘胜超，王金帅，赵德萍，雷霞，崔云甫

1.双鸭山双矿医院普外科，黑龙江 双鸭山 155100；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 155000；3.哈尔滨医科大学附属第二医院普外科，黑龙江 哈尔滨 155000

术后高凝状态导致肺栓塞是胃癌病人重要死因之一[1-2]。使用低分子肝素预防性抗凝治疗可降低血栓发生率，但明显增加出血、切口感染等并发症的发生率[4-5]，且仍常有致命性血栓事件发生[3]。探讨胃癌病人术后高凝状态形成机制，发现精准抗凝靶点，对改善胃癌病人生存质量具有重大意义。

中性粒细胞外捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是一种新型中性粒细胞死亡方式，由细胞外DNA构成主要骨架，周围附着中性粒细胞相关蛋白的网状结构[6]。除具有杀菌作用外，在凝血系统激活、血栓形成过程中起着重要作用[7-10]。肿瘤、炎症、免疫反应可诱导中性粒细胞释放NETs[11-14]，因此我们检测胃癌病人术前、术后血液中NETs形成情况，并评估其促凝功能，阐明NETs在胃癌术后高凝状态形成中的作用。现将本研究结果报告如下。

资料与方法

一、研究对象

选取2018年4月至2021年6月在双鸭山双矿医院普外科行腹腔镜辅助胃癌根治手术病人21例，并收集21名健康志愿者作为对照组。排除标准：<18岁，病人有急慢性感染、血管系统疾病、糖尿病、肝肾功能障碍，或者合并其他肿瘤、血小板或凝血功能障碍，服用抗凝或抗血小板药物者[11]。本研究得到医院伦理委员会批准[批件号:2018-01(省)]，所有病人均签署知情同意书。

二、方法

1.无血小板血浆、中性粒细胞准备 通过两部离心方法准备无血小板血浆，中性粒细胞利用Percoll密度离心法准备，详见文献[11]。

2.NETs生成情况检测 通过改良ELISA法检测髓过氧化物酶-DNA复合体(MPO-DNA)来评估NETs生成情况，详见文献[11]。

3.体外NETs形成实验 正常人中性粒细胞(1×106)在37 °C， 5%二氧化碳条件下，分别加入磷酸盐缓冲液稀释的正常人血浆、病人术后血浆(浓度为1∶50)孵育3 h。通过改良酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测NETs生成情况。利用免疫荧光显微镜进一步观察中性粒细胞释放NETs情况，方法同文献[11] 。

4.凝血功能检测 利用DNA酶-1分解NETs，通过ELISA法检测凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex，TAT)来间接评估NETs促凝功能，方法同文献[11]。

三、统计学处理

结 果

一、胃癌病人手术前后和正常人临床资料比较

21例病人包括TNM分期Ⅱ期5例，Ⅲ期16例，与对照组比较，年龄、性别差异均无统计学意义(均P>0.05)； 但凝血指标D-二聚体、TAT及NETs水平均显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；胃癌病人术后TAT、D-二聚体、NETs水平与术前相比均显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

二、体外培养中性粒细胞生成NETs情况

免疫荧光双标显示，胃癌病人术后血浆刺激组NETs(MPO-DNA复合体)阳性细胞数量明显多于对照组(图1A、B)。对生成NETs的中性粒细胞进行计数量化后，统计分析，发现术后病人血浆刺激组NETs含量显著高于对照组，阳性细胞百分比显著升高(6.930±1.832比3.190±0.637，P<0.01，图1C)。在酶标仪450 nm波长下检测，与对照组相比，术后病人血浆刺激组中性粒细胞MPO-DNA吸光度值也显著升高(0.381±0.117比0.213±0.053，P<0.01，图1D)。

三、NETs与胃癌病人术后血浆高凝状态的相关性

为进一步检测NETs的促凝功能，我们在体外利用DNA酶-1处理胃癌术后病人外周血浆后，发现TAT生成量明显下降[(1 008.35±359.52)ng/L比(675.16±167.89) ng/L，P<0.001](图2)， 但与对照组[(381.037±69.536) ng/L]比较仍显著升高(P<0.001，图2)。

表1 胃癌病人手术前后和正常人临床资料比较

注：MPO.髓过氧化酶；对照组为正常人血浆干预组，术后血浆组刺激组为胃癌术后病人血浆干预组。图1 胃癌术后血浆促进NETs生成 A、B.DNA(绿色)和MPO(红色)免疫荧光标记典型图片，MPO与DNA共定位为释放NETs的中性粒细胞(Merged图中红色箭头所示)，比例尺：50 μm；C.中性粒细胞中髓过氧化酶-DNA复合体(MPO-DNA)阳性细胞数百分比(aP<0.01)；D.MPO-DNA复合体A450值(bP<0.01)。

注：TAT.凝血酶-抗凝血酶复合物；对照组为正常人血浆，术后组为术后病人血浆，DNA酶-1组为采用DNA酶-1对术后病人血浆进行干预；与对照组相比，采用独立样本t检验，aP<0.01；与术后组相比，采用配对t检验，bP<0.01。图2 DNA酶-1对胃癌病人术后血浆生成凝血酶-抗凝血酶原复合物的影响

讨 论

炎症、肿瘤、免疫等多种因素可以诱导NETs形成[12]。我们利用病人术后的血浆刺激正常人中性粒细胞，发现NETs生成明显增加，说明病人术后体内存在促进中性粒细胞释放NETs的成分。我们既往研究[11]发现胃癌病人的中性粒细胞容易释放NETs。Cools-Lartigue等[13]与Najmeh等[14]分别在动物实验模型中发现术后炎症反应是肿瘤小鼠术后NETs升高的原因。Demers等[15]发现带瘤小鼠受到二次刺激后或合并感染时NETs生成明显增加，并有促凝、促进血栓形成作用。这些结果进一步支持了我们的结论即胃癌病人术后NETs生成增加，并促进高凝状态形成。

本组实验结果揭示NETs能够促进胃癌病人术后高凝状态形成，但结果还显示利用DNA酶-1处理胃癌病人术后血浆并不能使TAT生成量下降到与对照组相似的程度。 Boone 等[16]发现NETs可通过激活血小板、释放组织因子等途径促进胰腺癌高凝状态形成。因此NETs促进胃癌病人术后高凝状态形成机制需进一步行体内体外实验来阐明。

综上所述，NETs升高可能是诱导胃癌病人术后高凝状态形成的原因之一。降解或抑制NETs表面的DNA功能有望改善胃癌病人术后高凝状态。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突