胃黏膜病变中异常的黏蛋白表达及糖基化修饰

邹 龙，杨爱明

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1消化内科 2病理科，北京 100730

糖基化是蛋白质最常见的翻译后修饰。通过不同的糖基转移酶等催化，蛋白质与糖基共价相连，形成不同糖基化修饰的糖蛋白。糖蛋白是细胞的主要成分，其糖基结构参与细胞的多种关键生理过程，包括蛋白质的折叠、受体激活和信号转导、细胞黏附、免疫监视等。如果蛋白质糖基化异常，细胞的生物学行为可能改变，这与多种疾病甚至肿瘤发生发展密切相关[1]。

黏蛋白是一类具有相似分子结构的高度糖基化的蛋白质家族，其蛋白质核心富含脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)。黏蛋白经过糖基化修饰形成的聚糖分子可占总体质量的50%～90%，并最终决定黏蛋白的生化特性和功能[2]。目前鉴定出的黏蛋白家族有22个成员，分为分泌型黏蛋白和膜结合型黏蛋白，主要分布于上皮细胞。分泌型黏蛋白包括MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC 6～8、MUC19，通过层叠作用形成黏液凝胶层，覆盖于上皮细胞表面，发挥保护上皮的作用；膜结合型黏蛋白包括MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC11～13、MUC15～17、MUC20～22等，通常定位于上皮细胞的顶端，维持上皮细胞极性，其胞外区聚糖结构参与构成黏液，胞内区参与信号转导，影响细胞的增殖、细胞与细胞及细胞外基质间的相互作用等。

细胞和组织如果发生了生理状态的改变，会影响黏蛋白的糖基化修饰和表达。黏蛋白及其聚糖在临床方面已经表现出很高的应用价值，比如血清学标志物CA15- 3、CA125所检测的对象分别为MUC1、MUC16，它们已经作为乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤诊断及预后的标志物。这些诊断标志物虽已成熟应用，但对疾病早期诊断的敏感性低，疾病特异性也不高。另外，以MUC1等黏蛋白为靶点已经开展了多种免疫治疗方法的探索，但目前主要应用于卵巢癌、结肠癌、肺癌等恶性肿瘤[3]。监测黏蛋白的表达及糖基化修饰在疾病过程中的变化，对于胃黏膜病变发现早期诊断标志物也有帮助，在疾病的干预与治疗方面也有应用前景。

正常胃黏膜的黏蛋白表达及糖基化修饰

胃黏膜表面覆盖的黏液可通过物理、化学机制保护上皮细胞，也能与胃腔内病原体相互作用，发挥生物性保护功能，并参与调节宿主免疫反应。构成胃黏液的最主要分子为黏蛋白。黏蛋白的分布具有细胞和组织特异性。正常胃黏液主要由分泌型黏蛋白MUC5AC、MUC6和膜结合型黏蛋白MUC1的胞外区参与构成，前两者分别为胃表面上皮细胞、幽门腺体深部的细胞分泌，后者广泛存在于表面上皮细胞的顶端。MUC1除了富含O-聚糖的胞外结构，还有富含酪氨酸的高度保守的胞内区，通过酪氨酸的磷酸化，与众多蛋白质相互作用，调节胞内信号转导[4]。

基于黏蛋白的蛋白质核心的结构特点，其糖基化修饰主要为黏蛋白型O-糖基化，即糖基与Ser或Thr残基羟基的氧原子相连。这种糖链结构简单，但连接形式繁多。黏蛋白型O-糖基化的第1步均由N-乙酰氨基半乳糖转移酶催化，将乙酰氨基半乳糖残基供给Ser或Thr的羟基，形成Tn抗原。随后多见的反应模式为Tn抗原由半乳糖转移酶催化，合成T抗原，又称Core1。再由乙酰氨基葡萄糖转移酶催化形成Core2，并进一步分支、延伸形成聚糖的主链和末端结构。正常胃上皮细胞中，Core2是黏蛋白糖链的主要核心结构，Tn、T抗原通常不会单独表达[5- 6]。黏蛋白糖链末端主要为ABH血型抗原、Lewis血型抗原。MUC5AC、MUC1糖链末端主要是Lea、 Leb血型抗原，由岩藻糖转移酶参与合成[4]。MUC6糖链末端主要为Lex、 Ley血型抗原，另外还有α- 1，4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶参与催化合成含有α-GlcNAc的糖链末端[2]。

催化黏蛋白型O-聚糖形成的糖基转移酶在不同物种、个体、组织、生理状态有特异性表达模式，可识别特定氨基酸序列，调节O-糖基化的位点和密度，从而决定不同组织和器官的糖基化模式[7]。唾液酸转移酶在正常胃上皮细胞中较少表达，多在病理状态下出现，参与Lea、Lex抗原和Tn、T抗原的唾液酸化，分别合成唾液酸-Lea(sialy-Lea，SLea)、唾液酸-Lex(sialy-Lex，SLex)抗原和唾液酸-Tn(sialyl-Tn，STn)、唾液酸-T(sialyl-T，ST)抗原。STn、ST抗原的合成会导致糖链的提前终止，形成不成熟的截短聚糖，影响黏蛋白构型及功能。

幽门螺杆菌感染后的黏蛋白及其糖基化修饰改变

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)感染影响全球超过50%的成年人口，我国的感染率甚至超过70%[8]。约90%的胃部恶性肿瘤与Hp感染相关，1%～3%感染者可能发生胃癌或黏膜相关淋巴组织淋巴瘤[9- 10]。因而，Hp被WHO认定为Ⅰ类致癌物。黏蛋白作为胃黏膜的屏障，在Hp感染及致病过程中发挥重要作用。

Hp的外膜蛋白具有凝集素样的结合特性，可识别聚糖，是介导Hp在胃内定植以及Hp与上皮细胞黏附的重要分子。目前研究最多的是血型抗原黏附素(blood group antigen binding adhesin，BabA)和唾液酸黏附素(sialic acid-binding adhesin，SabA)。BabA优先与Leb血型抗原结合；SabA主要与唾液酸化的抗原SLea和SLex结合，是致病Hp在胃内最常见的黏附方式[11]。它们的结合强度受pH值的影响，在中性环境中结合强度最高。正常状态下，主要为MUC5AC携带Leb抗原，而很少有唾液酸化的聚糖存在。因此，表达BabA的Hp多与MUC5AC共定位于接近上皮细胞表面的黏液层。这是Hp一种自我保护机制，使细菌免受胃腔内机械、化学因素的影响。Hp与MUC5AC结合会使Hp随着胃的蠕动排出胃腔，减少胃内细菌密度，也减少Hp与上皮细胞表面MUC1或糖脂的结合[11]。当黏膜处于炎症状态，上皮细胞表达白细胞介素(interleukin，IL)- 1β、IL- 2、IL- 6、IL- 8、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等促炎性细胞因子增多。这些促炎性细胞因子会激活解聚素金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM17)、TNF-α转化酶(TNF-α convertase，TACE)等蛋白酶，诱导MUC1分子的胞外糖链结构解离，使与其结合的细菌被排出[4，12]。Hp慢性感染时，上皮细胞唾液酸合成酶表达上调，导致黏蛋白唾液酸化，不成熟截短聚糖表达增多，糖基化的总量下调。再加上MUC1这种胞外结构的改变，黏蛋白对黏膜的保护作用会受到影响，使上皮细胞对外界刺激更敏感，导致炎症状态的持续。

Hp与黏蛋白型O-聚糖相互作用，会对细菌的生长和致病产生影响。健康胃黏膜产生的黏蛋白可抑制Hp生长。这一方面是由于BabA与Leb抗原结合会抑制Hp生长[7]；另一方面，MUC6糖链末端分子α-GlcNAc可抑制Hp细胞壁的重要组成成分胆甾醇-α-D-吡喃葡萄糖苷的合成，从而通过抗生素样作用抑制Hp的生长，避免Hp分布于胃黏膜深部腺体[13]。另外，Hp外膜蛋白的表达具有动态性，这是细菌对宿主的一种适应能力，在Hp相关疾病的发生和发展中发挥重要作用。BabA与Leb抗原相结合会使细菌BabA表达减少而优先表达SabA，促进Hp与炎性胃黏膜的黏附[14- 15]。毒力因子cagA、ureA表达与BabA、SabA水平呈线性正相关[13]，这类细菌具有更强的致病性，与胃体萎缩、肠上皮化生、癌变等多种胃黏膜疾病相关[7]。

Hp会影响宿主黏蛋白的分泌、表达以及黏蛋白的糖基化。Hp感染使MUC5AC的分泌速度明显减慢，并抑制黏蛋白的合成，导致表达MUC5AC、MUC1的上皮细胞明显减少[16- 17]。在Hp感染状态下，MUC6在胃表面上皮细胞中出现异常表达及定位[17]，但整体表达量没有差异性变化[16]。

胃黏膜癌前状态黏蛋白及其糖基化修饰改变

Correa级联反应是目前公认的一种肠型胃癌的发病模型：由于Hp感染等因素引起胃黏膜慢性炎症，导致多灶性腺体萎缩，并随着萎缩的进展，上皮细胞出现肠上皮化生、异型增生，最终发生癌变。据估计，慢性萎缩性胃炎者胃癌发生率为(0.53～15.24)/1000人年，肠上皮化生者胃癌发生率为(0.38～17.08)/1000人年[18]。低级别异型增生和高级别异型增生诊断后5年内胃癌年发生率分别为0.6%和6.0%[19]。这些癌前状态下，黏蛋白及其糖基化修饰也发生变化。

免疫组织化学半定量分析发现，萎缩性胃炎黏膜MUC5AC、MUC6表达均下调[20]。在正常胃黏膜中MUC6与α-GlcNAc共表达；而在慢性萎缩性胃炎患者的幽门腺中，α-GlcNAc表达量相对于MUC6显著降低，Ki- 67指数相对更高[21]。

根据组织形态学和黏蛋白表达特征，肠上皮化生分为完全型肠上皮化生(Ⅰ型)和不完全型肠上皮化生(Ⅱ、Ⅲ型)。不同的肠上皮化生类型有不同的预后表现，Ⅰ型肠上皮化生黏膜癌变的风险并未增加，而Ⅱ型、Ⅲ型肠上皮化生癌变相对危险度分别提高至2.14和4.58[22]。黏蛋白表达及糖基化修饰的差异是不同肠上皮化生类型的主要鉴别点之一。完全型肠上皮化生同时具有杯状细胞、吸收细胞和潘氏细胞，其中杯状细胞合成和分泌MUC2，而MUC1、MUC5AC和MUC6在化生细胞中的表达完全缺失。不完全型肠上皮化生有杯状细胞和柱状细胞，其中杯状细胞表达和分泌肠型黏蛋白MUC2，多数情况下胃型黏蛋白MUC1、MUC5AC、MUC6也在杯状细胞和柱状细胞中均有表达[23- 24]。Ⅱ型肠上皮化生表达中性或唾液酸化的黏蛋白，Ⅲ型肠上皮化生为硫酸化的黏蛋白。肠上皮化生的上皮细胞中，Tn和STn的表达增加。STn主要分布于杯状细胞，以MUC2为载体；Tn则主要分布于柱状上皮[5]。

异型增生的上皮细胞免疫组织化学特征与不完全型肠上皮化生相似，同时具有胃型、肠型黏蛋白表达，伴有STn抗原表达的异常升高[25]。MUC5AC表达量在出现高级别异型增生时，较低级别异型增生增多，而MUC6表达进一步下降，其糖链末端α-GlcNAc分子减少更明显，Ki- 67也更高[25- 26]。

胃癌的黏蛋白及其糖基化修饰改变

根据我国肿瘤登记数据，2015年全国胃癌新发病例40.3万例，累积发病率为2.29%，居癌症发病谱第2位；死亡病例29.09万例，累积死亡率为1.5%，居癌症死亡顺位第3位。中国人群胃癌世界人口标化发病率和死亡率为全球人群世界人口标化发病率和死亡率的2倍[27]。减轻胃癌的疾病负担，仍是我国卫生健康行业需要重点努力的方向。肿瘤的生长是由于细胞异常分裂，逃避死亡信号和免疫监视，并且迁移至其他部位形成的。黏蛋白及其糖基化修饰的改变在肿瘤发生的每个过程中都发挥重要作用，参与癌细胞中信号传导、肿瘤细胞的解离和侵袭、细胞-基质相互作用、免疫调节和转移等细胞生物学过程[28]。

胃癌有多种病理分型方式，临床多用的是Lauren分型，将胃癌分为肠型和弥漫型。肠型胃癌是最多见的病理类型，多认为由肠上皮化生进展而来。肠型胃癌细胞中，Core2的表达量减少，MUC6糖链末端的α-GlcNAc表达也减少，而T抗原、硫酸化聚糖和STn、ST等不成熟的唾液酸化聚糖表达量较正常上皮细胞增多[6]。α-GlcNAc缺乏与更深的肿瘤浸润、脉管浸润相关[29]，STn表达的增多也是不良预后的独立危险因素[30]。Ozaki等[31]也发现MUC1异常表达STn与胃癌更强的转移能力相关，其机制可能为STn增多使肿瘤细胞与基质蛋白的黏附减少[4]。肠型胃癌组织中，MUC2的表达异常升高，也是携带STn最主要的黏蛋白，转移至淋巴管内的肿瘤细胞也可见携带STn的MUC2聚集。肠型胃癌组织MUC1、MUC3、MUC4、MUC5B的表达量增多，而MUC5AC、MUC6表达下降[26]。MUC1的过表达与胃癌发生脉管浸润、淋巴结转移和同步肝转移相关[32]，MUC4在胃癌中表达升高是肿瘤不良生存预后的危险因素[33]。若背景黏膜MUC6表达缺失，则Ki- 67阳性细胞分布更多且也更广，提示预后可能更差[34]。MUC1等膜结合型黏蛋白截短聚糖表达的增多会暴露抗原决定簇，与β-catenin形成胞内复合物，调节Wnt信号通路，激活细胞核内cyclin-D1的表达，抑制细胞凋亡并形成肿瘤[3]。并且，MUC1等膜结合型黏蛋白异常表达的唾液酸化聚糖会与免疫细胞表面表达的凝集素siglec结合，抑制NK细胞、树突状细胞、Th1细胞的活化，促进免疫细胞分泌IL- 10、转化生长因子-β等细胞因子，发挥免疫逃避及免疫抑制特性[4]。

结 论

胃黏膜从正常状态逐步发展为胃癌的过程中，上皮细胞黏蛋白及其糖基化修饰发生了异常的动态改变。MUC5AC表达的下调和黏蛋白唾液酸化聚糖表达的增多贯穿于整个疾病发展过程中，削弱了黏蛋白的保护作用。从萎缩性胃炎阶段开始，MUC6表达量下调，其重要的糖链末端分子α-GlcNAc水平也出现更高程度的降低。处于这种异常黏蛋白表达及糖基化状态的病变则预后更差。当上皮细胞发生肠上皮化生，MUC2即异常表达于胃部。若肠上皮化生状态下，硫酸化聚糖表达异常增多，则预示更高的癌变风险。MUC1等膜结合型黏蛋白在胃癌中表达升高，其糖基化修饰也以截短的唾液酸化聚糖为主。这除了减弱对上皮细胞的保护，还会抑制细胞凋亡和宿主免疫，提示更差的预后，但也可作为干预的靶点。黏蛋白表达及糖基化修饰的改变反映了疾病状态，反过来也会改变疾病进程。了解这些分子改变有利于认识胃上皮病变过程，对分子结构的鉴定有助于寻找潜在的诊断、预后标志物，甚至治疗靶点。但由于糖蛋白结构及合成过程的复杂性和异质性，实现其在疾病诊断和治疗中的应用依然任重而道远。