NLRP3及其抑制药物在肾缺血/再灌注损伤中的研究进展

陈 涛，蔡 飞，江波涛

(1.湖北科技学院药学院；2.咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院药学部;3.湖北科技学院糖尿病 心脑血管病变湖北省重点实验室；4.咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院泌尿外科，湖北 咸宁 437100)

肾缺血/再灌注损伤(renal ischemic reperfusion injury，RIRI)易发生于机体休克、肾脏移植、心肺复苏等疾病，以肾功能下降为主，轻者可引起急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)，严重患者会进展为急性肾衰竭，目前尚无有效的预防措施和治疗策略。RIRI的发病机制有：肾素-血管紧张素系统的激活、细胞内钙离子超载、细胞的凋亡与自噬、机体氧化应激、微循环功能障碍和炎症反应等。其中，炎症反应是RIRI中研究较多的病理机制之一。

Nod样受体蛋白3((Nod-1ike receptor protein 3，NLRP3)与多种肾脏性疾病的发病机制密切相关，包括糖尿病肾病、晶体相关性肾病、慢性肾病、AKI等。研究显示[1-3]，NLRP3炎症小体在RIRI的疾病进展中同样扮演着重要角色。

1 NLRP3炎症小体的结构及活化

NLRP3(又称NALP3、冷冻蛋白、CIAS1、PYPAF1和CLR11)位于染色体1q44上，属于NLR蛋白家族中NLRP(nod-like receptor protein)亚家族成员之一，它是一种大分子蛋白复合体，其组成成分包括NLRP3、凋亡相关微粒蛋白(apoptosisassociated speck-like protein，ASC)和天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteases-1，caspase-1)蛋白。当NLRP3激活后，其N-末端的效应结构域(Pyrin domain，PYD)识别并结合ASC的PYD，募集ASC和caspase-1的前体，从而形成NLRP3炎症小体。

NLRP3炎症小体的激活包括线粒体反应性氧化物[4]、胞内钾离子外流[5]、自噬功能障碍[6]、溶酶体裂解[7]等。主要有两种信号参与NLRP3炎症小体的激活，一是NF-κB等转录因子，通过上调NLRP3炎症小体形成基因的表达，并产生IL-18和IL-1β等前体[8]；二是通过NLRP3炎症小体激活后，募集相应的炎症因子，生成活化的caspase-1，从而使IL-18、IL-1β等的前体剪切成熟[9-10]。最终NLRP3炎症小体通过识别并结合内源性(如尿酸盐结晶、细胞外三磷酸腺苷、胆固醇晶体、脂肪酸等)或外源性(如生物纳米材料、淀粉样沉淀、石棉等)损伤相关分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)[11]而完成自身的组装活化，介导无菌炎症。

2 NLRP3与肾缺血/再灌注损伤(RIRI)

2.1 NLRP3参与RIRI的机制在肾缺血/再灌注(renal ischemic reperfusion，RIR)过程中，随着肾小管上皮细胞的损伤和坏死，会产生大量内源性的DAMPs，如高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)、ATP、线粒体活性氧(eROS)和热休克蛋白等，从而激活NLRP3，导致肾小管坏死。

以往研究认为,NLRP3主要由免疫细胞表达，但在RIRI中却有两种细胞参与NLRP3的表达，分别是免疫细胞和肾细胞。Bakker等[3]的研究显示，免疫细胞表达的NLRP3可导致肾小管上皮细胞凋亡、坏死，且肾小管上皮细胞的病变程度与免疫细胞表达的NLRP3数量正相关；而肾细胞表达的NLRP3则影响肾小管上皮细胞的修复，这种影响主要表现为阻碍肾小管上皮细胞修复。可见无论是在减少肾小管上皮细胞损伤还是促进修复的过程中，NLRP3始终扮演着消极的角色。

尽管已经明确参与RIRI疾病进展的NLRP3有免疫细胞源性和肾细胞源性，但具体发病机制尚不完全清楚，目前认为主要是通过炎症小体依赖途径和非炎症小体依赖途径进行的。

Iyer等[1]通过研究野生型(WT)小鼠、NLRP3-/-小鼠和ASC-/-小鼠在发生RIRI后肾小管的坏死程度，发现无明显差异。存在显著差异的是肾间质中中性粒细胞的浸润情况和肾功能，其中肾间质中性粒细胞浸润最明显、肾损伤严重的是WT小鼠，而NLRP3-/-小鼠、ASC-/-小鼠相较WT小鼠均有所改善，但ASC-/-小鼠是在再灌注后的5 d观察到改善，而NLRP3-/-小鼠在再灌注后的24h就观察到这种差异。在致死性RIR后，NLRP3-/-小鼠与ASC-/-小鼠的存活率均有所提高，其中NLRP3-/-小鼠更明显。这些差异显示NLRP3在RIRI中很可能存在炎症小体依赖和非炎症小体依赖途径。

随后，Shigeoka等[2]也证实了NLRP3可以通过非炎症小体依赖途径发挥作用。通过比较WT小鼠和NLRP3-/-小鼠，发现在RIRI后，WT小鼠的肾小管坏死程度更重、肾功能损伤更明显；且在NLRP3-/-小鼠中，检测到IL-1β和IL-18明显偏低。随后对IL-1β-/-小鼠、IL-18-/-小鼠、ASC-/-小鼠及caspase-1-/-小鼠RIRI后的肾功能情况进行检测，发现无明显改善。IL-1β-/-小鼠和IL-18-/-小鼠的肾功能结果说明，NLRP3缺陷相关的肾脏保护作用独立于炎症小体介导的IL-1β和IL-18的释放。

2.2 NLRP3在RIRI中的激活途径

2.2.1P2X4和P2X7诱导NLRP3炎症小体激活 Iyer等[1]发现RIRI后，随着肾小管细胞坏死，线粒体释放的ATP增多，大量的ATP可通过刺激P2X7受体来诱导NLRP3炎症小体激活。Qian等[12]通过与WT小鼠对比研究发现，P2X7R(-/-)小鼠在RIRI后肾功能得到改善，且炎症因子产生减少，NLRP3被抑制；在缺氧/复氧(H/R)的诱导下，发现急性肾损伤患者的近端肾小管上皮细胞(HK-2)的ATP释放增多，而缺血所致的AKI，在消耗HK-2外ATP和使用P2X7受体拮抗剂后均可改善，且同时检测到NLRP3炎症小体被抑制。

有研究报道P2X4和P2X7[13]在氨基酸序列、生理学通道、染色体位置和组织分布等方面极其相似，存在异构共表达，因此Han等[14]推测NLRP3炎症小体也可被P2X4受体诱导激活。通过比较P2X4WT小鼠和P2X4KO小鼠，发现P2X4KO小鼠对RIRI所致的AKI保护作用明显，可使肾小管坏死程度减轻，炎症反应和NLRP3炎症小体信号显著减弱；而在使用了P2X4激动剂TPγS后，P2X4WT小鼠的近端肾小管细胞中NLRP3炎症小体的信号明显增强。因此，NLRP3炎症小体可被P2X4受体和P2X7受体诱导激活，但是否都通过ATP-P2X4/P2X7-NLRP3途径，有待进一步研究。

2.2.2通过ROS-TXNIP-NLRP3途径激活NLRP3炎症小体 Xiao等[15]发现糖尿病大鼠RIRI后NLRP3炎症小体的激活是由硫氧还原蛋白-相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)介导并依赖于活性氧(ROS)。

Wen等[16]的研究验证了该结论，在缺血/再灌注损伤(SIRI)诱导的HK-2中，发现TXNIP的表达、TXNIP和线粒体的共定位均增强。而使用线粒体靶向抗氧化剂MitoTempo处理HK-2后，发现线粒体膜电位(MMP)的下降，mROS的产生减少，与此同时NLRP3炎症小体和TXNIP的激活和共定位均被抑制，而NLRP3炎症小体在TXNIP siRNA转染的HK-2中是明显被抑制的。这些结果提示，ROS-TXNIP-NLRP3途径可激活NLRP3炎症小体。

2.2.3CTSB和CTSL可促进NLRP3炎症小体的激活 Tang等[17]发现组织蛋白酶B(CTSB)和组织蛋白酶L(CTSL)可促进体内NLRP3炎症小体的激活，从而加剧RIRI。研究发现在H/R诱导的HK-2的上清液中，CTSB和CTSL的缺失可使caspase-1和IL-1β的表达明显抑制；将CTSB及CTSL siRNA在体外转染入H/R诱导的HK-2中，发现由于siRNA转染降低了mRNA水平和CTS的活性，IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1等蛋白的表达也相应下调，因此推测CTSB和CTSL能够诱导NLRP3炎症小体的激活。在使用CTSB特异性抑制剂Ca074Me对小鼠进行预处理，发现血清肌酐和肾脏组织病理学变化显著减弱，证实了CTSB可有效减轻RIRI。由于Ca074Me对酶的抑制与剂量相关，在高剂量下可抑制多种组织蛋白酶[18-19]，因此实验还选用1 μmol·L-1Ca074Me(CTSB抑制剂)和15 μmol·L-1Ca074Me(CTSB与CTSL抑制剂)对H/R诱导的HK-2进行预处理，发现CTSB和CTSL的活性显著降低，肾脏NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的表达也减弱。该研究表明，CTSB和CTSL可促进NLRP3炎症小体的激活，阻断CTSB和CTSL可减轻RIRI。

2.2.4通过激活Nrf2来抑制NLRP3炎症小体的激活 Liu等[20]已证实，激活Nrf2可抑制TXNIP-TRX1复合物的解离，从而阻止TXNIP激活NLRP3蛋白。Pang等[21]研究也发现,激活Nrf2/NLRP3信号通路可抑制caspase-1/焦亡相关蛋白gasdermin D(GSDMD)介导的细胞焦亡，从而减轻RIRI。

2.3 RIRI中抑制NLRP3激活的药物

2.3.1羟氯喹 Tang等[17]在RIR手术前1周，使用羟氯喹(10 mg·kg-1·d-1)连续灌胃雄性小鼠，发现羟氯喹可通过下调RIR小鼠的NF-κB信号从而抑制NLRP3炎症小体的激活。

2.3.2右美托咪定 Kim等[22]分别在肾缺血前1 h和再灌注后给予雄性糖尿病大鼠右美托咪定(10 μg·kg-1)，发现由RIRI所致的NLRP3、caspase-1、IL-1β、phospho-AKT和phospho-ERK等上调信号，均被减弱；但再灌注后使用右美托咪定在调节NLRP3、phospho-AKT和phospho-ERK等信号传导以及氧化应激方面明显优于缺血前给药。

2.3.3多酚酸盐B Pang等[21]在RIR手术前1周，分别给予雄性小鼠高(200 mg·kg-1·d-1)、中(100 mg·kg-1·d-1)和低(50 mg·kg-1·d-1)剂量的多酚酸盐B，发现3组药物均可减轻RIRI所致的AKI，其中高剂量组效果最显著。机制研究发现多酚酸盐B可直接激活Nrf2的核表达，抑制RIR时机体的氧化应激反应、NLRP3炎症小体的激活、促炎因子释放以及细胞焦亡。

2.3.4促红细胞生成素 Kwak等[23]在雄性小鼠双侧肾动脉闭塞前30 min和再灌注前5 min分别给予促红细胞生成素(500 IU·kg-1)1次，发现给予促红细胞生成素的RIR小鼠的细胞凋亡减少，氧化应激反应降低，巨噬细胞浸润减少，ICAM-1和MCP-1的表达被抑制。研究证实，促红细胞生成素可通过激活COX-2和NF-κB信号通路来下调NLRP3、caspase-1和NLRP1等的表达。

2.3.5紫花前胡苷 Liao等[24]在RIR手术前用紫花前胡苷(20 mg·kg-1·d-1)连续灌胃雄性小鼠3 d，结果发现紫花前胡苷预处理组的肌酐和尿素氮较RIR组明显下降，肾小管损伤程度显著减轻。经H/R诱导的HK-2在使用紫花前胡苷处理后，TNF-α、IL-1β和IL-6的表达明显抑制，并且紫花前胡苷还能抑制ROS及NLPR3炎症小体的激活。

2.4 RIRI中抑制NLRP3激活的化合物

2.4.1白藜芦醇 Xiao等[15]在给雄性糖尿病大鼠连续灌胃白藜芦醇(10 mg·kg-1·d-1)7 d后行RIR手术，发现白藜芦醇能抑制糖尿病大鼠RIRI后TXNIP与NLRP3的结合，以及caspase-1、IL-1和IL-18的表达。

2.4.2表氧化二十碳三烯酸 朱晔等[25]在RIR手术前1 h，分别给雄性小鼠注射表氧化二十碳三烯酸(2 mg·kg-1)、TLR4抑制剂TAK242(3 mg·kg-1)各1次，发现表氧化二十碳三烯酸能够减轻小鼠RIR所致的肾功能损伤和炎症反应。该保护作用可能与抑制TLR4通路有关，该通路可抑制NLRP3活化并介导细胞焦亡。

2.4.3A68930 Cao等[26]在RIR后，给雄性小鼠注射3次A68930(5 mg·kg-1)，发现A68930能激活D-1多巴胺受体，抑制NLRP3炎症小体的激活，减轻肾脏和系统炎症，改善RIR所致的肾功能异常。

2.4.4白头翁皂苷B4 李俊等[27]使用低(1.25 mg·kg-1·d-1)、中(2.5 mg·kg-1·d-1)、高(5 mg·kg-1·d-1)剂量的白头翁皂苷B4对RIR后的雄性大鼠，连续治疗5 d，发现大鼠RIRI减轻，其中高剂量组最明显。其研究表明，抑制炎症是RIRI治疗的关键，可通过抑制NLRP3信号通路及TLR4/NF-κB信号通路来实现。

2.4.5四甲基吡嗪 Sun等[28]于RIR后立即给雄性大鼠腹腔注射盐酸四甲基吡嗪(40 mg·kg-1，间隔6 h)，发现与RIR组比，盐酸四甲基吡嗪组血清肌酐、血尿素氮、TNF-α、IL-6等水平均较低，肾组织NLRP3表达下调。经H/R诱导的HK-2在使用盐酸四甲基吡嗪后，HIF-1α和NLRP3的表达均被下调。

2.4.6Mcc950 Zou等[29]在肾移植后使用MCC950(50 mg·kg-1，每周2次)对雄性大鼠进行治疗，发现MCC950可通过NLRP3-IL-1β趋化因子轴对肾移植产生保护作用。武康[30]在肾缺血前15 min，通过鼠尾静脉给雄性小鼠注射MCC950(3 mg·kg-1)，发现与RIR组相比，接受MCC950治疗的小鼠，肾功能显著改善，肾组织损伤程度减轻，NLRP3、IL-1β和caspase-1的表达被抑制。

3 NLRP3在RIRI研究中的总结与展望

综上，NLRP3可作用于RIRI的多个环节，包括炎症反应、肾小管上皮细胞的凋亡和修复等。研究NLRP3参与RIRI的发病机制及激活途径，有助于阐明RIRI的病理过程，并针对性的进行干预，是RIRI预防和治疗的关键。目前虽有部分研究，但以炎症小体依赖途径为主，非炎症小体依赖途径的研究甚少。而这两种途径又均可加剧RIRI ，因此后期需对非炎症小体依赖途径进行更深入的研究。近些年RIRI的发病机制还聚焦于自噬、细胞凋亡和坏死等，这些也为RIRI的预防和治疗提供了新思路。

多种药物或化合物通过抑制NLRP3的激活来减轻RIRI方面，相关文献报道以动物研究为主，尚无临床使用研究。但动物模型与人RIRI在发病机制、临床表现等都相似，通过动物模型可有助于筛选出较理想的药物或化合物，对寻找安全有效的RIRI治疗方案十分重要；且目前的动物模型治疗效果均较显著，后期以进一步的临床试验结果做支撑，NLRP3非常有望成为治疗RIRI的新靶点。