镇心安神方对辣椒素诱导的背根神经节细胞瞬时受体电位通道蛋白及自噬蛋白表达的影响

卢亮，刘勇，东淳，李阳梅，冯霞，陈若曦，赵一丁

1.陕西中医药大学，陕西 咸阳712046；2.陕西省中医医院，陕西 西安 710003

瘙痒是一种可引发搔抓意愿和搔抓反射的特异性皮肤感觉，可由多种皮肤疾病和系统性疾病引起[1]，其中超过6周的瘙痒称为慢性瘙痒。目前国内外对痒觉的研究虽确定了相关受体和信号通路，但对痒觉信号的产生、传导及调控的机制仍不清晰。有研究显示，皮肤病患者瘙痒患病率为54.4%[2]。其发病机制不清，治疗手段有限，长期慢性瘙痒严重影响患者生活质量，甚至造成焦虑、抑郁、失眠等中枢神经系统疾病[3]。

中医治疗慢性瘙痒具有独特优势。既往研究表明，中药内服、外用及非药物疗法可通过抑制神经活性物质释放，调节信号传导通路及相关受体活性改善慢性瘙痒[4]。镇心安神方是以《素问·至真要大论篇》“诸痛痒疮，皆属于心”为理论指导形成的治疗方剂，由龙骨、煅牡蛎、骨碎补、茯苓、淡竹叶组成，具有重镇安神、平肝潜阳、健脾补肾作用。课题组前期应用本方治疗慢性瘙痒性皮肤病取得可靠的临床疗效[5]，并通过实验初步表明本方对慢性皮炎模型动物搔抓行为具有抑制作用[6]。本研究通过体外实验，观察镇心安神方含药血清对辣椒素诱导的小鼠背根神经节（DRG）细胞瞬时受体电位（TRP）通道蛋白TRPA1、TRPV1、TRPM8及自噬蛋白LC3表达的影响，为镇心安神方治疗慢性瘙痒性皮肤病提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

6～8周龄雄性SD大鼠12只，体质量180～200 g，1～3日龄C57BL/6小鼠150只，购自湖北省实验动物研究中心，动物许可证号SCXK（鄂）2015-0018。饲养于西安交通大学医学院实验动物中心，温度18～24℃，湿度50%～70%，12 h光照/黑暗循环，自由饮水进食。大鼠适应性饲养7 d开始灌胃，新生小鼠适应性饲养24 h分离原代DRG细胞。

1.2 药物、试剂与仪器

镇心安神方（龙骨30 g，煅牡蛎30 g，骨碎补10 g，茯苓20 g，淡竹叶30 g），免煎颗粒购自广东一方制药有限公司，将免煎颗粒以蒸馏水充分溶解，配制成原药材浓度为1 g/mL混悬液，置于4℃保存备用。辣椒素，上海阿拉丁生化科技有限公司，货号C107193；辣椒平，美国Cayman公司，货号10007518；TRPA1抗体，以色列Alomone Labs，货号ACC-037-25；TRPV1抗体、TRPM8抗体，美国Gene Tex公司，货号分别为GTX54762、GTX54886；LC3抗体，美国Affinity公司，货号AF5402；Cy3标记羊抗小鼠IgG，武汉博士德公司，货号BA1031；β-tubulin，美国CST公司，货号4466；神经元无血清培养基，武汉普诺赛公司，货号CM-M166。XTL型体视显微镜（凤凰光学集团），FV3000型激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯公司），MCO-15AC型CO2恒温培养箱（日本SANYO公司），ECLIPSE Ts2型倒置显微镜（日本Nikon公司），5702R型低速离心机（德国Eppendorf公司），Flexstation®3型酶 标仪（美国MD公司），DYCZ-40型电转仪、DYCZ-24DN型垂直电泳槽（北京六一仪器厂），JY300型水平电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。

1.3 含药血清制备

12只大鼠按随机数字表法分为空白组和镇心安神方组，每组6只。给药剂量根据人与大鼠体表面积折算[7]，空白组予蒸馏水10 mL/（kg·d）灌胃，镇心安神方组予镇心安神方混悬液6.3 g/（g·d）灌胃，2次/d，连续7 d。末次给药前禁食12 h，自由饮水，给药1 h后0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血，常温静置2 h以上，4℃、3 000 r/min离心15 min，血清56℃水浴30 min灭活，0.22μm滤膜过滤，即得空白血清和镇心安神方含药血清，置于-20℃冰箱保存备用。

1.4 小鼠背根神经节细胞分离及培养

75%乙醇消毒小鼠全身，超净台内断头处死，剪开背部皮肤，打开脊髓腔，用显微镊取出双侧DRG，置预冷DMEM培养基中，加入Ⅰ型胶原酶（3 mg/mL）2 mL，37℃消化30 min，吸去液体，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化15 min，待细胞脱壁后加入完全培养基（90%DMEM+10%胎牛血清）终止消化，将细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃去上清，用神经元无血清培养基重悬细胞，接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中静置培养，次日向培养基内加入阿糖胞苷（5μmol/L）抑制非神经细胞生长，48 h后更换正常神经元专用培养基。

1.5 免疫荧光鉴定背根神经节细胞

在培养皿中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗3次，0.5%Triton X-100室温透明20 min；PBS浸洗3次，吸水纸吸干PBS，滴加山羊血清，室温封闭30 min；吸水纸吸去封闭液，加β-tubulin一抗（1∶100），4℃湿盒孵育过夜；加Cy3标记羊抗小鼠IgG（1∶50），37℃湿盒孵育1 h，PBST浸洗3次，滴加DAPI，避光孵育5 min，对标本进行核染，PBST洗去多余DAPI，吸水纸吸干液体，封片，荧光显微镜下观察并采集图像。

1.6 造模、分组及干预

将原代DRG细胞以1×104个/孔接种至6孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。将细胞分为对照组、模型组、镇心安神方含药血清组和辣椒平组，每组3个复孔。对照组、模型组和辣椒平组用20%空白血清预处理4 h，辣椒平组同时加入终浓度为1µmol/L的辣椒平，镇心安神方含药血清组用10%镇心安神方含药血清和10%空白血清预处理4 h，然后模型组、镇心安神方含药血清组和辣椒平组加入1µmol/L辣椒素，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h建立瘙痒模型[8]。

1.7 Western blot检测

收集各组细胞，加入裂解液裂解，提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，依次加样、凝胶电泳、转膜、室温封闭，滴加TRPV1抗体（1∶200）、TRPA1抗体（1∶500）、TRPM8抗体（1∶500）、LC3抗体（1∶1 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜5次，每次5 min；滴加HRP标记二抗（1∶50 000），37℃摇床孵育2 h；TBST洗膜，ECL发光液曝光，显影液显影，采用Bandscan 5.0软件计算蛋白表达量。

1.8 统计学方法

采用SAS6.12软件进行统计分析。计量资料用±s表示，对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐用方差分析，方差不齐用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 背根神经节细胞鉴定

接种的细胞大部分在4～6 h开始贴壁，呈圆形或椭圆形，胞体周围出现一圈光晕。接种后24 h，大部分贴壁细胞长出突起，多数细胞为具有多个突起的多极神经元，少数为双极和假单极神经元，随着培养时间延长，神经元突起的主干和分支明显延长并增粗，神经细胞呈圆形或椭圆形，胞体较大，折光性好，光晕强，交织成密集的神经元网络，突起细长，见图1。DRG细胞几乎不增殖，免疫荧光染色结果显示，DRG神经元胞体及突起表现为β-tubulin染色阳性，呈红色荧光，细胞核表现为DAPI染色阳性，呈蓝色荧光，见图2。

图1 DRG细胞形态

图2 DRG细胞鉴定（免疫荧光染色，×400）

2.2 镇心安神方含药血清对细胞瞬时受体电位通道蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组细胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，镇心安神方含药血清组细胞TRPV1、TRPA1蛋白表达降低，辣椒平组细胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与辣椒平组比较，镇心安神方含药血清组细胞TRPA1蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05），TRPV1、TRPM8蛋白差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图3、表1。

表1 各组细胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达比较（±s）

表1 各组细胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；与辣椒平组比较，△P＜0.05

组别对照组模型组镇心安神方含药血清组辣椒平组n 3 3 3 3 TRPV1 0.167±0.013 0.674±0.096*0.461±0.068#0.408±0.058#TRPA1 0.165±0.030 0.570±0.083**0.411±0.021#△0.317±0.051#TRPM8 0.160±0.017 0.545±0.095**0.386±0.030 0.293±0.062#

图3 各组细胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白免疫印迹

2.3 镇心安神方含药血清对细胞LC3蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，镇心安神方含药血清组和辣椒平组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与辣椒平组比较，镇心安神方含药血清组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高（P＜0.05）。见图4、表2。

图4 各组细胞LC3蛋白免疫印迹

表2 各组细胞LC3蛋白表达比较（±s）

表2 各组细胞LC3蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与辣椒平组比较，△P＜0.05

组别对照组模型组镇心安神方含药血清组辣椒平组n 3 3 3 3 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.178±0.026 0.776±0.102**0.551±0.061#△0.341±0.083##

3 讨论

瘙痒发作依赖于皮肤组织中细胞与神经纤维相互作用，这一过程涉及众多细胞、介质、受体及通路，常表现为痒觉敏感、痒觉异常及自发性瘙痒，其核心机制为痒觉神经通路敏化和调节功能失调[9]。TRP通道是存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的一类非选择性阳离子通道蛋白，对Ca2+具有高通透性，易被生理性或亚生理性刺激（如温度变化、化学及机械压力）激活，导致Ca2+内流增加，细胞膜去极化，神经元活化阈值降低，是发生痒觉神经敏化的重要基础[10]。在慢性瘙痒性皮肤病患者中，普遍存在神经生长因子、内皮素1、胸腺基质淋巴细胞生成素等瘙痒介质释放增加[11]，这些介质可促进末梢神经生长和数量增加，上调神经肽类递质表达，激活TRP家族成员TRPV1和TRPA1[12]，通过组胺依赖性神经通路和组胺非依赖性神经通路传递瘙痒信号。

研究发现，细胞内游离Ca浓度对自噬和诱导自噬有重要调节作用[13]，但Ca2+对自噬的调控机制尚存在争议。有研究显示，Ca2+对自噬有抑制作用[14]。也有文献报道Ca2+对自噬过程有促进作用[15]。TRP通道是重要的Ca2+调控通道，对细胞内Ca2+浓度变化有“门控”作用。有研究表明，TRP通道可作为细胞自噬的调节器[16]，TRPV1通过AMPK信号通路抑制自噬，减轻心肌细胞缺氧损伤[17]，辣椒素能增加自噬标志物LC3Ⅱ和Atg5表达，进而诱导自噬[18]。TRPM型相关蛋白可通过增加细胞内游离Ca2+浓度，激活自噬并促进细胞生长[13]。

《素问·至真要大论篇》有“诸痛痒疮，皆属于心”，王冰注曰：“心寂则痛痒微，心燥则痛痒甚，百端之起，皆自心生，痛痒疮疡生于心也。”《灵枢·邪客》亦有“心者，五脏六腑之大主也，精神之所舍也”，指出皮肤疾病与心神的关系。镇心安神方临床用于特应性皮炎、荨麻疹等瘙痒性皮肤病治疗，选用具有镇心安神、清心除烦、健脾补肾作用的药物，损有余，补不足，从整体上改善患者瘙痒和睡眠，打破瘙痒-搔抓恶性循环，提高患者生活质量。方中重用龙骨、煅牡蛎，龙骨主要成分为碳酸钙、磷酸钙[19]，煅牡蛎主要成分为碳酸钙、微量元素和氨基酸[20]，骨碎补主要成分骨碎补总黄酮可调节体内Ca2+水平[21]，推测以上药物配伍对体内Ca2+代谢和功能具有调控作用。

综上，本研究结果表明，镇心安神方对辣椒素诱导的DRG细胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达具有抑制作用，可能通过对细胞内Ca2+浓度的调节，下调自噬相关蛋白LC3表达，从而保护神经细胞，降低其兴奋性，阻断痒觉信号传导。