基于nrDNA和cpDNA序列的甘肃省4种肉苁蓉种质资源分子鉴定

康舒淇，徐丽，张明惠，陈博，晋玲，2，3，朱田田，2，3

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.西北中藏药省部共建协同创新中心，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省珍稀中药资源评价与保护利用工程研究中心，甘肃 兰州 730000

肉苁蓉为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma和管花肉苁蓉Cistanche.tubulosa（Schenk）Wight的干燥带鳞叶肉质茎[1]。全球约有22种肉苁蓉属植物，多分布于北半球欧亚温暖的沙漠、荒漠等干燥地带。据《中国植物志》记载，中国的肉苁蓉属植物主要有5种，包括肉苁蓉C.deserticolaY.C.Ma、管花肉苁蓉C.tubulosa（Schenk）Wight、盐生肉苁蓉Cistanche salsa（C.A.Mey.）G.Beck、沙苁蓉Cistanche sinensisG.Beck及兰州肉苁蓉Cistanche.lanzhouensisZ.Y.Zhang，主要分布在新疆、内蒙古、甘肃等西北部地区[2]。肉苁蓉不仅具有较高的药用价值，因其有利于沙漠治理和土壤改善，也具有较高的生态效益[3]。甘肃省作为2020年版《中华人民共和国药典》规定正品肉苁蓉的主要分布省份之一，野生蕴藏量和人工种植面积的合理规划和采收尤为重要[4]。随着经济发展及国民健康需求的不断增加，肉苁蓉需求量日益增长，通过对甘肃肉苁蓉资源现状进行实地调查[5]，发现在皋兰、靖远等多个地区仍然存在对野生肉苁蓉的大规模、灭绝式采挖现象，致使野生资源受到严重破坏。非药典种在民间大量使用的现象时有发生，大量伪品肉苁蓉进入药市[6]，种质混乱势必造成商品肉苁蓉质量参差不齐，严重影响其经济价值，因此对不同种质的肉苁蓉进行准确鉴定尤为重要。

分子鉴定技术因样品用量少、速度快、准确性高，已被广泛用于动植物的物种鉴定[7]，而当前对甘肃肉苁蓉的种质资源分子鉴定研究还未见报道。本研究以核基因片段nrDNA的ITS和CD序列、叶绿体基因片段cpDNA的matK和rbcL序列为研究对象，对甘肃省不同种质肉苁蓉进行分子鉴定，以期寻找适合肉苁蓉分类的基因序列，并探究种质内与种质间的差异，实现肉苁蓉种质的快速准确鉴别，以此探讨肉苁蓉种质间的分类地位，为甘肃肉苁蓉资源的评价、保护和利用提供参考依据。

1 仪器与试药

OHAUS Corporation DV SERIES型电子天平，奥豪斯仪器有限责任公司；DK-98型数显恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；TGL-16M型高速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；G1000改进型基因聚合酶链式反应（PCR）仪，杭州博日科技有限公司；4100型凝胶成像处理系统，上海天能科技有限公司；Vortex-Genie 2T型涡旋混匀器，德国IKA公司；BCD-451WDEMU1型冰箱，青岛海尔股份有限公司。

NEP003-2型植物基因组提取试剂盒（批号B00B00103），北京鼎国昌盛科生物技术有限责任公司；β-巯基乙醇（批号20191103）、Agarose琼脂糖（批号0000590598）、BSA（批号20191203）、引物、Taq DNA Polymerase（批号W9910e）、dNTPs（批号R6409）、GoldView核酸染料（批号321523BB）等PCR试剂，上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker（批号20190601），大连宝生物股份有限公司；乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇为分析纯，天津市大茂化学试剂厂；水为屈臣氏纯净水。

肉苁蓉样品共27份，多数为自采，部分为市场购买，其中肉苁蓉（C.deserticola）16份、沙苁蓉（C.sinensis）6份、盐生肉苁蓉（C.salsa）4份、兰州肉苁蓉（C.lanzhouensis）1份。经甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为以上基原肉苁蓉的肉质茎，所有样品采集后于干燥硅胶中保存，样品来源信息见表1。

表1 肉苁蓉样品来源信息

2 方法与结果

2.1 肉苁蓉基因组DNA提取与质量检测

用75%乙醇擦拭样品表面后置于2 mL离心管中，粉碎成细粉。采用植物基因组DNA快速抽提试剂盒提取样品的基因组DNA，提取操作方法参照试剂盒说明书。由于肉苁蓉药材多糖含量较高，对DNA提取有一定干扰，故在此方法基础上用75%乙醇纯化DNA 3～4次。提取的基因组DNA于-20℃冰箱中保存。采用电泳1%琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，于电泳仪（220 V，50 mA，30 min）进行基因组DNA完整性检测。电泳完成后，置于凝胶成像仪下观察，选取条带清晰明亮，无明显拖尾杂带的DNA用于后续分析。

2.2 PCR扩增及测序

2.2.1 引物信息

在查阅文献[8-10]的基础上进行筛选，选用扩增成功率较高的4对引物：ITS2-ITS3、CD1F-CD1R、matK3F-matK1R和rbcL1F-rbcL724R。引 物 信 息见表2。

表2 肉苁蓉基因组序列PCR引物信息

2.2.2 反应体系与检测

PCR扩增总体系为25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol/L）2.0μL，BSA 0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，正向及反向引物各0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 15.5μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，根据不同引物的退火温度复性30 s，72℃延伸45 s，35个循环，72℃延伸7 min，4℃保存。27份肉苁蓉样品经4对引物扩增后电泳检测，其扩增条带清晰明亮，扩增成功率均为100%（见图1）。将符合测序条件的PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序。

图1 肉苁蓉基因组序列部分PCR产物电泳

2.3 结果分析

2.3.1 样品测序结果

将测序所得序列文件用Chromas和ContigExpress软件去除两端不稳定信号的低质量碱基，用以校对峰图，并将每个样品测序后的正反向序列拼接[11]，对拼接后的每条序列峰图进行检查及人工校对，将处理得到的样品序列及采集信息上传至GenBank数据库。ITS2F-ITS3R序列登录号为OL827059-OL827085，CD1F-CD1R序列登录号为OL827086-OL827112，matK3F-matK1R序列登录号为OL827113-OL827139，rbcL1F-rbcL724R序列登录号为OL827140-OL827166（见表3）。

表3 肉苁蓉样品序列GenBank登录号

2.3.2 肉苁蓉序列特征

27份肉苁蓉样品均被成功扩增和测序，使用Mega X软件[12]中ClustalW程序将4对引物扩增出的序列进行比对，再分别将nrDNA和cpDNA序列联合得到2组合并序列的序列特征（见表4）。4对序列的GC含量分别为56.8%、56.9%、30.3%和41.3%，而cpDNA合并序列GC含量比nrDNA合并序列低，为34.6%。

表4 肉苁蓉样品序列特征

2.3.3 核苷酸多态性

运用DanSP5.10.01软件[13]进行核苷酸多态性分析，肉苁蓉样品在ITS、CD、matK和rbcL序列的碱基位点中存在着不同程度的变异，其中，matK序列的变异位点、单一突变位点、简约信息性位点、插入-缺失位点及平均核苷酸差异数均明显高于其余3对序列，共检测到481个变异位点、369个单一突变位点、112个简约信息位点和88个插入-缺失位点，平均核苷酸差异数为62.761。cpDNA合并序列的变异位点、单一突变位点、简约信息性位点、插入-缺失位点及平均核苷酸差异数均明显高于nrDNA合并序列，共检测到534个变异位点、388个单一突变位点、146个简约信息位点和120个插入-缺失位点，平均核苷酸差异数为77.276，但其核苷酸多样性低于nrDNA合并序列（见表5）。

表5 肉苁蓉样品核苷酸多态性信息

2.3.4 单倍型多样性

根据DanSP5.10.01软件分析结果，发现肉苁蓉样品的4对序列和2组合并序列的单倍型多样性均大于0.5，值越大，则可推断多样性程度越高。在4对序列中，matK序列中单倍型数量最多，共形成21个单倍型；2组合并序列中，cpDNA序列的单倍型多样性更高，其单倍型数量达到24个（见表6）。

表6 肉苁蓉样品单倍型多样性

2.3.5 种质遗传距离分析

基于kimura2-parameter（K2P）模型计算肉苁蓉ITS、CD、matK和rbcL4对序列的种质遗传距离（见表7）可知，4对序列的平均遗传距离为0.209 3、0.010 8、0.109 4、0.027 1，经比较其遗传距离ITS＞matK＞rbcL＞CD。4对序列得到的所有样品遗传距离范围分别为0～1.405 6、0～0.064 1、0～0.992 5、0～0.077 3。对比可得，ITS和matK序列的变异性较大，CD和rbcL序列较保守。此外，计算遗传距离均显示兰州肉苁蓉与肉苁蓉的遗传距离最近，使用matK序列通过GraphPad Prism 8.0.1软件绘制遗传距离矩阵热图，遗传距离为0.001 2（见图2）。

表7 肉苁蓉不同序列种质遗传距离

图2 肉苁蓉matK序列遗传距离矩阵

2.3.6 聚类分析

通过GenBank数据库下载草苁蓉属Boschniakia植物丁座草Boschniakia himalaicaHook.f.et Thoms.序列信息（ITS和CD为AY911212.1，matK为MH659839.1，rbcL为MG546905.1），以其为外类群与nrDNA和cpDNA序列及2组合并序列构建邻接法（NJ）聚类树[14]，结果表明，外类群丁座草可单独聚为一支，4对序列在属水平上的鉴定成功率均为100%。ITS和CD序列聚类图显示，27份肉苁蓉样品可聚为3类，其中样品27单独为一个进化支，样品6、11、12、13、14、19、21、22、26、24为一个进化支，其余为一个进化支（见图3A、图3B）。matK序列聚类图显示，27份肉苁蓉样品可聚为4类，其中样品13单独为一个进化支，样品22、21、24、14为一个进化支，样品19、1、23、16、20、18、17为一个进化支，其余为一个进化支（见图3C）。rbcL序列聚类图显示，27份肉苁蓉样品可聚为4类，其中样品26、6、2分别为一个进化支，其余为一个进化支（见图3D）。2组合并序列聚类图表明，nrDNA合并序列可将大多数沙苁蓉、盐生肉苁蓉与正品肉苁蓉区分开，只有样品11、12、13未能区分（见图3E）；cpDNA合并序列则可将样品13单独聚为一个进化支，其余肉苁蓉聚为另一个进化支，从而进行有效鉴别区分（见图3F）。所有构建的NJ聚类树均显示样品1、23、21、22（盐生肉苁蓉）分别为不同进化支，样品1和23为一个进化支，样品21和22则为另一个进化支，且兰州肉苁蓉始终与肉苁蓉聚为一支。

图3 肉苁蓉样品基因组序列NJ系统聚类树

2.3.7 方差分析

将采样地不同但属于同种的肉苁蓉样品归为一组，共分为3组，即肉苁蓉组、盐生肉苁蓉组和沙苁蓉组，采用Arlequin3.5软件[15]对nrDNA和cpDNA合并序列进行方差分析（见表8），结果表明，肉苁蓉遗传变异主要来自组内变异，即同一物种不同种质间分化明显。ITS和CD的合并序列遗传分化指数（Fst）为0.206 8，基因流（Nm）为1.01；matK和rbcL的合并序列Fst 为0.230 7，Nm为0.92，说明肉苁蓉不同种质间存在一定基因流动，但基因交流不频繁。

表8 肉苁蓉样品基因组序列方差分析

3 讨论

以往研究表明，nrDNA ITS序列进化速率快，变异信息位点较丰富，被广泛应用于植物的遗传多样性分析[16]。而cpDNA序列则可提供丰富的遗传信息，为评估物种遗传多样性和亲缘关系提供科学参考[17]。本研 究 利 用4对 引 物（ITS2-ITS3、CD1F-CD1R、matK3F-matK1R和rbcL1F-rbcL724R）进行序列比对、遗传距离分析及NJ聚类树的构建，结果表明，肉苁蓉种质资源多样性程度较高，且在种质间水平上均有丰富的变异性。毕毓芳等[18]研究表明，matK序列是进化速率最快的叶绿体基因组序列，常在科级、属级、种间和种内水平上被用于系统进化研究。马丽等[19]在对石榴种质资源进行基因组序列分析时发现石榴物种的matK基因片段扩增及测序成功率高，聚类准确度较强。董斌等[20]研究发现，在matK序列变异位点较多的情况下，遗传差异也较大，有利于鉴别同一物种的不同种质。本研究中，matK序列是4对序列中变异位点最多的序列，具有481个变异位点，其中单一突变位点为369个，所占比例最大，是变异的主要来源。按Grant等[21]提出的标准，单倍型多样性以0.5为临界值，核苷酸多样性以0.005为临界值，二者值越大，群体的多样性程度越高。4对序列中matK序列单倍型多样性最高，而cpDNA合并序列的单倍型多样性明显高于nrDNA合并序列，因此，matK序列更适合作为肉苁蓉遗传多样性分析的序列，也证明了叶绿体基因片段在群体遗传学研究中的优越性。此外，对盐生肉苁蓉，由于采集样品地理位置的差异，发现不同地区的同种肉苁蓉也存在地理遗传差异性，与杨俊誉等[22]研究结果一致。

分子鉴定技术可有效对中药材进行准确鉴别，是对传统经典鉴定方法的有效补充，弥补了经典鉴定方法的不足[23]。近年来，许多学者为实现对物种进行快速鉴定，对适合植物物种鉴定的基因序列进行了深入研究，其中主要包括ITS、ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL序列[24]。徐素素等[25]认为，单独类型的序列鉴别存在一定局限性，分子鉴定体系的完善需要多条序列联合应用。李波等[26]在研究中使用核基因片段与叶绿体片段相结合的方法，从而达到提高物种鉴别效率。本研究以nrDNA和cpDNA序列构建NJ聚类树，发现单独某对序列并不能在种水平上有较好的鉴别效率。ITS和CD序列聚类图表明，多数肉苁蓉与沙苁蓉、盐生肉苁蓉亲缘关系较远，会分别聚于不同进化支，但也存在小部分肉苁蓉与其他物种聚为一支的情况；matK和rbcL序列聚类图表明，沙苁蓉与盐生肉苁蓉亲缘关系较近，可聚为同一大支，而两物种又会分别聚为不同小支，但部分肉苁蓉和盐生肉苁蓉存在聚类混乱的情况，不能准确鉴别。故将nrDNA和cpDNA序列联合使用，可进一步实现对肉苁蓉种质的快速、准确鉴别。

兰州肉苁蓉在《中国植物志》中作为单独的物种具有一定植物学分类地位，但近年来也有学者建议将兰州肉苁蓉及沙苁蓉归为同个物种[27]。而陈博等[6]在对甘肃肉苁蓉进行指标性成分含量测定研究发现，兰州肉苁蓉与沙苁蓉成分含量存在一定差异，与肉苁蓉成分含量较为相似。本研究中，通过计算遗传距离及构建NJ聚类树，结果兰州肉苁蓉与肉苁蓉的遗传距离较近，均可聚为同一个进化支。由此，建议将兰州肉苁蓉与其他肉苁蓉进行分类区别，考虑作为正品肉苁蓉的药源补充，提高其资源开发利用度，后续可就此问题进行深入研究。

近年来，随着对肉苁蓉药材需求量的提升，为保证临床安全用药，对肉苁蓉种质资源的鉴别、评价及保护至关重要。本研究基于nrDNA和cpDNA序列，对甘肃省4种肉苁蓉进行分子鉴定，结果表明肉苁蓉种质资源多样性程度较高，可为进一步细化肉苁蓉不同种质资源的分类提供参考。