拉合尔钝缘蜱不同龄期若蜱超微形态

韦丽婷, 刘丹丹, 范士龙, 王金明, 芦 星, 李思媛, 刘明明, 陈宋琴, 刘一凡, 郭庆勇, 巴音查汗, 张 伟

(新疆农业大学动物医学学院, 乌鲁木齐 830052)

拉合尔钝缘蜱Ornithodoroslahorensis是一种重要的体外专性吸血寄生虫，隶属节肢动物门(Arthropoda)蛛形纲(Arachnida)蜱螨亚纲(Acari)蜱目(Ixodida)软蜱科(Argasidae)钝缘蜱属Ornithodoros(艾力西热·买买提等, 2017)。在国外主要分布于俄罗斯、乌克兰、巴基斯坦等国家和地区，在国内主要分布于新疆、甘肃和河南等地区(孔繁瑶, 1997; 于心等, 1997; 刘洋, 2012; 孙明, 2016; Zhaoetal., 2019)。该蜱为新疆地区软蜱中的优势种，主要分布于新疆吐鲁番、喀什等地区(艾力西热·买买提, 2017; Zhaoetal., 2018b, 2019)。拉合尔钝缘蜱常寄生于牛、羊、骆驼和犬等(Sonenshine and Roe, 2014; 张璘, 2014; Zhaoetal., 2018a)，在吸血过程中除了造成动物皮肤损伤外，更严重的可能将自身携带的病毒、细菌、立克次体、寄生虫等病原传播给宿主，对流行地区的养殖业、畜牧业发展及人员安全造成了巨大的威胁(Jeppesenetal., 2012; Zhaoetal., 2018a, 2019)。

目前对于拉合尔钝缘蜱的相关研究主要集中在流行病学调查、生物防治等方面(Philip and Burgdorfer, 1961; Sidorov and Kriuchechnikov, 1968; Sureauetal., 1980; Reháceketal., 1989; Estrada-Pea and Jongejan, 1999; Zhaoetal., 2018a, 2019)，其形态学特征研究仅有少量关于成蜱期及部分若蜱期的形态特征报道(孔繁瑶, 1997; 于心等, 1997; 艾力西热·买买提等, 2017; 吕继洲等, 2017)。据研究表明，钝缘蜱的生活史需要经历卵、幼蜱、若蜱和成蜱4个阶段，其中若蜱期一般需经历2～9个龄期，其若蜱的龄期数根据钝缘蜱种类不同而存在差异。目前对于钝缘蜱若蜱各龄期的划分，主要以蜕皮次数为依据，对于以若蜱形态特征为不同龄期区分依据的研究还未见报道(Landulfoetal., 2012; Ribeiroetal., 2013; Ramirezetal., 2016; Diyes and Rajakaruna, 2017; González-Moragaetal., 2018)。因此，本研究在前期进行拉合尔钝缘蜱生活史研究的基础上，借助体视显微镜和扫描电子显微镜对拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱形态结构特征进行全面、细致的观察研究并补充完善其形态学参数，旨在为拉合尔钝缘蜱若蜱期龄期划分提供依据，对补充软蜱不同龄期的鉴别特征依据具有重要参考价值。

1 材料与方法

1.1 样品采集与饲养

拉合尔钝缘蜱样品由新疆农业大学动物医学学院兽医寄生虫学实验室采集与保存。将雌蜱和雄蜱按照1∶2的比例放于密封容器中，再置于恒温生化培养箱中(温度25±1℃，相对湿度85%±5%，光周期12L∶12D)，待其产卵孵化为幼蜱后将其接种于成年雌性新西兰大白兔耳部，参照邵志然等(2017)待其饱血脱落后将幼蜱收集到培养管后放入培养箱中，待幼蜱第1次蜕皮后获得1龄若蜱，重复以上饲蜱、蜕皮步骤后依次获得2-5龄若蜱。

1.2 样品制备

选取培养中获得的处于饥饿状态下较活跃的1-5龄若蜱共10头(每龄期若蜱随机选择2头)，将样品浸没于80～90℃热水中1 min，处死的同时使其躯体达到舒展状态；将选取的样品经过超声波清洗3次，每次10 min，清洗干净后再用生理盐水冲洗；用游标卡尺测量各个阶段若蜱躯体的长与宽，并借助MOTIC ST-39B体视显微镜 (麦克奥迪实业集团有限公司)对拉合尔钝缘蜱不同龄期若蜱进行初步观察并用索尼A7RIV数码相机记录图像资料；随后置于2.5%戊二醛固定液中进行固定；再经梯度酒精逐级脱水，酒精浓度依次为30%, 50%, 70%, 90%和100%，每个浓度连续脱水2次，每次15 min；最终将样品置于100%叔丁醇中，4℃保存；将样品放入ALPHA1-2LD plus冷冻干燥机 [Christ (德国) 集团]；将干燥好的样品用镊子小心地粘附在贴有双面导电胶的样品台上，用108AUTO离子溅射仪Sputter Coater (广州竞化工科技有限公司)喷金；喷金后放入SIGMA 500场发射扫描电子显微镜[蔡司 (德国) 公司]、SU1510扫描电子显微镜[日立 (日本) 公司]下观察并拍照。

1.3 数据分析

使用Microsoft Excel处理实验所得数据，利用SPSS 20.0进行单因素方差分析(ANOVA)；利用Photoshop对电镜图片进行编排。

2 结果

2.1 体视显微镜下拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱主要形态

在体视显微镜下，拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱随着龄期的增长，躯体逐渐增大，除了躯体尺寸不相同以外，其他形态结构相似度较高。躯体长为躯体前端的顶突至躯体后缘的距离，躯体宽为第2基节之间水平体缘的距离，1龄若蜱躯体长1.70±0.12 mm，躯体宽0.89±0.11 mm；2龄若蜱躯体长3.12±0.44 mm，躯体宽1.67±0.21 mm；3龄若蜱躯体长5.14±0.52 mm，躯体宽2.79±0.36 mm；4龄若蜱躯体长6.39±0.32 mm，躯体宽3.47±0.21 mm；5龄若蜱躯体长7.82±0.38 mm，躯体宽4.22±0.34 mm。各期若蜱躯体均呈卵圆形或椭圆形，前端较窄，后部钝圆，呈深黄色或黄褐色；顶突逐渐明显，部分的口下板和须肢被掩盖；背、腹表皮粗糙，且高低不平，其上着生细毛；体中央色深呈棕褐色或者棕色；两侧缘较直且接近平行，体侧缘圆钝，呈淡黄色，背面与腹面交界处无缝线分隔；盘窝较浅且大小不一，排列不规则；足4对，中等长度，呈淡黄色，半透明；生殖孔还未形成，性别无法区分 (图1)。

图1 体视显微镜下拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱形态Fig. 1 Morphology of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under stereo microscopeA, F: 1龄若蜱1st instar nymph; B, G: 2龄若蜱2nd instar nymph; C, H: 3龄若蜱3rd instar nymph; D, I: 4龄若蜱4th instar nymph; E, J: 5龄若蜱5th instar nymph. A-E: 背面观Dorsal view; F-J: 腹面观Ventral view.

2.2 1-5龄若蜱共有形态特征

躯体背面、腹面表皮呈山脊样褶皱，盘窝呈圆形或椭圆形，排列不规则，背面和腹面均有刚毛(图2: A-E)。足由6个节段组成，从基部开始分别为基节、转节、股节、胫节、后附节、跗节，足末端有爪 (图3: A, B, E)，爪垫不发达 (图3: E)；每节段表面光滑无褶皱，且腹面连接处表皮为乳突样 (图3: C, D)；第1基节与第2基节分开，第2基节、第3基节、第4基节相互靠近 (图3: C, D)。第1对足的跗节背面有瘤突 (图4: B-E)；哈氏器位于第1对足的跗节背面，瘤突与瘤突之间，呈横裂样，前窝和后囊均有刚毛 (图4: B-E)。口下板呈矛形，齿占口下板的2/3，前端齿小，中部齿大，基部无齿排列 (图5: A-E)；须肢位于口下板两侧，由4个节段组成，每节段均附有刚毛 (图5: B-E)；假头基中等大小，头窝呈三角形，深而窄 (图5: D, E)。气门呈半圆形，气门板不发达，其表面密布大小不等的微孔，位于第4基节的背侧方(图6: A-E)。肛门呈圆形，由两对叶状肛瓣构成，其上有肛瓣毛，位于假头基后缘至躯体后缘的中部 (图7: A-D, F)。肛前沟从第2基节起至肛门前端 (图7: C)；肛后中沟自肛门起至躯体后部边缘 (图7: B)；无肛后横沟；未见生殖孔 (图7: A-C)。

图2 扫描电子显微镜下拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱表皮形态Fig. 2 Morphology of the cuticle of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1龄若蜱1st instar nymph; B: 2龄若蜱2nd instar nymph; C: 3龄若蜱3rd instar nymph; D: 4龄若蜱4th instar nymph; E: 5龄若蜱5th instar nymph. di: 盘窝Discs; st: 刚毛Setae.

图3 扫描电子显微镜下拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱足形态Fig. 3 Morphology of legs of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1龄若蜱1st instar nymph; B: 2龄若蜱2nd instar nymph; C: 3龄若蜱3rd instar nymph; D: 4龄若蜱4th instar nymph; E: 5龄若蜱5th instar nymph. cl: 爪Claw; c1-4: 第1-4基节1st-4th coxae; fe: 股节Femur; mt: 后附节Meta-tarsus; tb: 胫节Tibia; ta: 跗节Tarsus; tr: 转节Trochanter. 白色箭头为节段连接乳突样表皮。The white arrow indicates the intersegmental mammillae.

图4 扫描电子显微镜下拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱足跗节形态Fig. 4 Morphology of tarsi of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1龄若蜱1st instar nymph; B: 2龄若蜱2nd instar nymph; C: 3龄若蜱3rd instar nymph; D: 4龄若蜱4th instar nymph; E: 5龄若蜱5th instar nymph. ap: 前囊Anterior pit; cho: 哈氏器后囊Posterior capsule of Haller’s organ; ho: 哈氏器Haller’s organ; hu: 瘤突Hump.

图5 扫描电子显微镜下拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱口下板形态Fig. 5 Morphology of hypostomes of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1龄若蜱1st instar nymph; B: 2龄若蜱2nd instar nymph; C: 3龄若蜱3rd instar nymph; D: 4龄若蜱4th instar nymph; E: 5龄若蜱5th instar nymph. ca: 头窝Camerostoma; hy: 口下板Hypostome; pa: 须肢Palpus.

图6 扫描电子显微镜下拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱气门形态Fig. 6 Morphology of spiracles of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1龄若蜱1st instar nymph; B: 2龄若蜱2nd instar nymph; C: 3龄若蜱3rd instar nymph; D: 4龄若蜱4th instar nymph; E: 5龄若蜱5th instar nymph. nsp: 无气门板No spiracular plate; sp: 气门板Spiracular plate.

图7 扫描电子显微镜下拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱肛门形态Fig. 7 Morphology of the anus of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1龄若蜱1st instar nymph; B: 2龄若蜱2nd instar nymph; C: 3龄若蜱3rd instar nymph; D: 4龄若蜱4th instar nymph; E: 5龄若蜱5th instar nymph. an: 肛门Anus; mp: 肛后中沟Medium postanal grooves; pg: 肛前沟Preanal grooves.

2.3 1-5龄若蜱各龄鉴别特征

1龄若蜱：表皮刚毛长且粗；足的每节段及与腹面连接处表皮光滑，第1跗节无瘤突 (图4: A)；口下板前端凹陷明显，且凹陷的两侧较尖，口下板顶端齿式为2|2，口下板长为口下板顶端至假头基前缘，口下板长234.41±13.61 μm (图5: A)；气门呈半圆形，气门长径为95.39±12.36 μm，无气门板 (图6: A)；肛瓣毛2对，肛门长径为115.92±2.03 μm，未见肛前沟、肛后中沟 (图7: A)。

2龄若蜱：表皮刚毛长且粗；足连接处表皮为乳突样，第1跗节有3个不明显的瘤突 (图4: B)；口下板顶端有小凹陷，且凹陷的两侧圆钝，口下板顶端齿式为3|3，齿共3排，每排有5～6枚小齿；口下板中部齿式为2|2，有6～7排，每排有1～4枚大齿，长382.43±1.50 μm (图5: B)；气门半圆形，气门长径为118.70±5.59 μm，有气门板但不发达 (图6: B)；肛门长径为134.64±10.05 μm，肛前沟、肛中沟明显 (图7: B)。

3-5龄若蜱：表皮刚毛短且细；第1跗节有3个明显瘤突 (图4: C, D, E)；口下板顶端齿排列不规则，中部齿式排列为8～9排，每排有1～4个大齿 (图5: C, D, E)；3龄若蜱口下板长535.22±5.81 μm，4龄若蜱口下板长556.09±8.50 μm，5龄若蜱口下板长600.01±11.68 μm。3龄若蜱肛门缺失 (图7: C)，4龄若蜱肛瓣毛6对，肛门长径为191.19±4.70 μm (图7: D)，5龄若蜱肛瓣毛7对，肛门长径为198.82±5.44 μm (图7: E)。

综上所述，1-2龄若蜱的主要鉴别特征为瘤突、足连接处表皮形态、口下板与齿式、气门、肛前沟及肛中沟等特征；2-3龄若蜱的主要鉴别特征为刚毛、瘤突、口下板及齿式等特征；4-5龄若蜱的主要鉴别特征为肛瓣毛数量。

3 讨论

拉合尔钝缘蜱是新疆地区流行最广泛的软蜱之一，该蜱可以携带多种病原微生物，对人畜造成严重的危害。但目前国内外对其相关的研究较少，尤其是对于其不同发育时期形态结构特征的研究，尚未见详细报道。经过研究团队前期对于拉合尔钝缘蜱生活史研究发现，该蜱整个发育过程需经历卵期、幼蜱期、5个若蜱期(若蜱期间共蜕皮4次)、成蜱期4个阶段(韦丽婷, 2021)。在此基础上，本研究以拉合尔钝缘蜱各龄期若蜱为研究对象，借助体视显微镜和扫描电子显微镜首次全面细致地记录拉合尔钝缘蜱不同若蜱期形态学资料，并补充部分数据，为软蜱蜱种鉴定及生物学特征研究提供参考依据。

在体视显微镜下观察拉合尔钝缘蜱5个若蜱期形态结构特征发现，其宏观结构特征基本相似，仅在躯体尺寸方面存在细微差异，因此仅凭体视显微镜观察的结构特征来辨别不同龄期若蜱相对困难(图1)。通过比较拉合尔钝缘蜱各龄期若蜱与成蜱形态结构发现，若蜱和成蜱的体缘、缝线、盘窝排列等鉴别特征基本相似(孔繁瑶, 1997; 于心等, 1997; Ribeiroetal., 2013; 孙明, 2016)。因此，以上鉴别特征也可作为区别拉合尔钝缘蜱若蜱与其他软蜱若蜱的鉴别依据。

扫描电子显微镜观察结果显示，拉合尔钝缘蜱不同龄期若蜱表皮、盘窝、足、哈氏器及生殖孔等结构特征基本相似 (图2-4)，而刚毛、瘤突、口下板、齿式、气门、气门板、肛瓣毛、肛前沟、肛中沟等形态特征差异明显 (图2和图4-7)，因此上述特征可以作为拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱的主要鉴别特征。在此基础上，本研究还利用扫描电子显微镜测量软件测量了拉合尔钝缘蜱不同龄期若蜱躯体、口下板、气门和肛门等相关数据(图1和 图5-7)，进一步完善了于心等(1997)、艾力西热·买买提等(2017)和吕继洲等(2019)关于拉合尔钝缘蜱形态学的相关研究结果。

利用扫描电子显微图像比较拉合尔钝缘蜱若蜱与成蜱超微形态特征发现，两者微观结构存在明显差异，如刚毛、瘤突、口下板、齿式、气门、气门板、肛前沟、肛中沟及生殖孔等形态结构特征(图2-7)。通过比较拉合尔钝缘蜱与其他种类钝缘蜱的各期若蜱形态特征发现，在背部表皮、足连接处表皮、颊部、气门、肛后横沟等部位存在显著形态差异(图2-7)。具体差别表现为：在背部表皮形态方面(图2)，拉合尔钝缘蜱呈褶皱样，其他钝缘蜱呈乳突样；在足连接处表皮形态方面(图3)，拉合尔钝缘蜱呈微乳突样，塞氏钝缘蜱Ornithodorossavignyi呈褶皱样，而微冠钝缘蜱Ornithodorosmicrolophi、珐氏钝缘蜱Ornithodorosfaccinii均呈乳突样；在是否具有颊部方面(图5)，拉合尔钝缘蜱无颊部，好角钝缘蜱Ornithodoroscapensis、兜福钝缘蜱Ornithodorosperopteryx和洞栖钝缘蜱Ornithodoroscavernicolous均有颊部；在气门形态方面(图6)，拉合尔钝缘蜱呈半圆形，马氏钝缘蜱Ornithodorosmarinkellei呈长条形；在有无肛后横沟方面(图7)，拉合尔钝缘蜱无肛后横沟，而巴西钝缘蜱Ornithodorosbrasiliensis、珐氏钝缘蜱O.faccinii和尤马钝缘蜱Ornithodorosyumatensis均有肛后横沟(Estrada-Peaetal., 2004; Labrunaetal., 2011; Barros-Battestietal., 2012, 2015; Navaetal., 2013; Venzaletal., 2013; Abdel-Shafyetal., 2016; Muoz-Lealetal., 2018, 2020)。因此，本研究不仅补充了拉合尔钝缘蜱不同龄期若蜱的形态结构特征相关信息，而且为钝缘蜱及软蜱的鉴别提供了更加细致的形态特征比对依据。

虽然利用电子显微技术能够获得清晰详细的拉合尔钝缘蜱形态学资料，但是仍存在不足之处：比如，在进行扫描电镜拍摄前样品处理过程中，由于拉合尔钝缘蜱体表凹凸不平，导致喷金不均匀，为了获得各部位清晰图像，在拍摄时存在过度曝光的现象，如图4(A)、图5(B)和图6(D)中所示。又如，在进行样品清洗时，使用超声清洗可将蜱体表大部分杂质去除，但仍无法除去缝隙中、粘附性强的杂质，如图5(C-E)、图6(D-E)和图7(E)所示，若增大超声频率则有可能损坏躯体表面柔软的刚毛及其他鉴别部位，如图6(D)和图7(C)所示。因此，在后续的研究中需要进一步细化操作流程，避免在样品处理及拍摄过程中因操作不规范产生的影响蜱体形态特征的现象发生。又如，因拉合尔钝缘蜱样品来源较少，虫体较珍贵，因此本次研究仅在每期若蜱中随机选取2头，在测量具体部位参数时，对数据的统计分析仍存在误差。此外3龄若蜱因在电镜拍摄时喷金不均匀，导致获取图像不清晰而缺失3龄若蜱肛门数据。以上不足我们将在后续研究中进行进一步完善和优化。

综上所述，本研究利用体视显微镜和扫描电子显微镜，首次完整的对拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱鉴别特征进行描述，为拉合尔钝缘蜱不同龄期若蜱划分提供了形态学依据，为软蜱形态学及生活史研究奠定了理论基础。