产气荚膜梭菌毒素β1的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

马玲玲，马红梅，吴霜，王东，李勇，马臣杰，曾瑾

1．宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；2．宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川 750021

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，C.p.）又称魏氏梭菌，是一种革兰阳性厌氧芽孢形成菌，广泛分布于自然界，特别是土壤和人类、动物的肠道［1］，感染者血管中会出现气泡，该性状与坏疽性气体的感染症状相似［2］。该菌可引起人类食物中毒及动物的脓毒血症、坏死性肠炎、气性坏疽等疾病［3-4］，给人类健康和畜牧养殖业造成了严重威胁。据美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）统计，C.p.病是美国第二大常见食源性疾病，占总发病率的26%［5］。我国也有关于C.p.感染的报道，2016年，北京市顺义区暴发1 起由C 型C.p.毒素导致的食物中毒事件［6］；2015年，对我国4 个省份的907 份猪粪便样本进行检测，发现猪场普遍携带C. p.，母猪感染比例达75%，哺乳仔猪感染达80%［7］。

C.p.是一种条件致病菌，当外界环境或寄主环境适合其大量增殖，并分泌毒素时可导致疾病［8］，C.p.致病因子主要是其产生的外毒素及胞外水解酶。目前，已知C.p.分泌23 种外毒素或酶类［9］，其中α、β、ε、ι 为主要致死毒素，根据这4 种主要毒素，可将C.p.分为A、B、C、D、E 共5 种血清型。C.p.β1毒素（Clostridium perfringensBeta1 toxin，CPB1）是B和C 型菌株产生的一种成孔毒素，相对分子质量约34 000，等电点为5.6，以多聚体形式存在［10］，该毒素具有细胞毒性和神经毒性，可引起人和动物的坏死性肠炎。因此，早期检测C.p感染对相关疾病的预防和筛查尤为重要。目前，主要检测方法包括微生物分离培养鉴定法、普通PCR 法、实时荧光定量PCR法、ELISA 法和环介导等温扩增法等［11］。其中，普通PCR 检测法仅能进行定性检测，不能检测毒素基因的表达及分泌情况，还具有易出现假阳性、工作繁琐、周期长及不适用大批量检测等缺点；ELISA 法特异性及灵敏性高，易于操作，检测速度快，适用大量样品检测，广泛应用于临床疾病检测及实验室病原研究。本研究采用原核表达系统重组表达CPB1，以其为包被抗原建立检测CPB1 抗体的间接ELISA 法，并对CPB1的包被浓度、一抗稀释度、封闭条件、二抗稀释度等检测条件进行优化，同时确定方法的临界值，验证特异性、灵敏度、重复性，以期用于C.p.感染临床血清样品的检测和相应疫苗免疫效果的评价。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体及细胞 感受态E.coliBL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司；载体pET32a、C.p.A型菌（ATCC 3624和57-1）、C.p.B型菌（58-2）、C.p.C型菌（59-2和59-44）的培养液和E.coli（C83529、C83905、C83684、C83922、C14208）、单核细胞增生李斯特菌（ATCC19115）、沙门菌（CMCC50115）、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌的培养物均由宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室制备；CPB1杂交瘤细胞株1K19及21株CPB2杂交瘤细胞株均由艾比玛特医药科技（上海）有限公司制备。

1.2 血清 201 份牛血清样品采自宁夏某牛场；感染C.p.的2 份小鼠阳性血清及2 份免疫生理盐水的小鼠阴性血清均由宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室制备。

1.3 主要试剂及仪器 限制性核酸内切酶NcoⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及T4 DNA连接酶购自英国New England Biolabs公司；胰蛋白胨、酵母粉及脑心浸液培养基购自英国OXOID公司；彩色预染蛋白marker（26616）购自美国Thermo Fisher 公司；5×SDS-Tris-甘氨酸缓冲液购自上海百赛生物技术有限公司；琼脂糖（AGAROSE）购自法国BIOWEST 公司；IPTG、牛血清白蛋白及Tween20购自北京索莱宝科技有限公司；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自美国AxyGen 公司；GelRed购自美国Biotium 公司；氨苄青霉素及卡那霉素购自美国USBIOANALYZED 公司；20×PBS Buffer及琼脂粉（Agar）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；脱脂奶粉购自美国BD Difco 公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG北京中杉金桥生物有限公司；液体硫乙醇酸盐培养基购自青岛海博生物技术有限公司；快速封闭液购自新赛美生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；兔抗牛IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司；鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自武汉三鹰生物技术有限公司；胎牛血清及RPMI1640培养基购自美国Gibco 公司；AKTA 纯化系统及Protein G 均购自思拓凡科技有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.4 目的基因的扩增根据GenBank 中登录的cpb1基因序列（X83275.1），应用Primer Premier 5.0 软件设计引物，Forward：5′-CGCCATGGCTAATGATATAGGCAAAACTACTACTAT-3′，Reverse：5′-GAATGAATTCAATAGCTGTTACTTTATG-3′，扩增产物大小为930 bp。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。以C 型C. p.的59-2 基因组为模板扩增cpb1基因，PCR反应条件为：94 ℃5 min；94 ℃30 s，56 ℃45 s，72 ℃45 s，共30个循环；72 ℃5 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 重组质粒的构建 胶回收PCR产物，与载体pET-32a均经NcoⅠ及EcoRⅠ双酶切，回收目的基因和载体片段，以T4 DNA 连接酶于4 ℃连接过夜；连接产物涂布于含100 μg／mL 氨苄青霉素的LB 固体培养基，于37 ℃培养过夜；挑取单克隆，分别进行单酶切（EcoRⅠ）、双酶切（NcoⅠ和EcoRⅠ）和三酶切（NcoⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ）鉴定，阳性克隆送金斯瑞生物科技公司测序。将鉴定正确的质粒命名为pET32a-cpb1。

1.6 重组蛋白的诱导表达 将鉴定正确的重组质粒pET32a-cpb1转化感受态E.coliBL21（DE3），于37 ℃培养12 h；挑取阳性单菌落进行扩大培养，加入IPTG至终浓度0.1 mml／L，20℃诱导3 h；收集菌体，7 104×g离心5 min，PBS重悬沉淀，超声破碎，分别取上清和沉淀，进行12%SDS-PAGE 分析，同时设空载体和未诱导表达作为对照，BCA法测定蛋白浓度。

1.7 McAb 1K19的制备及纯化 将杂交瘤细胞株1K19于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养至对数生长期进行传代，继续培养至过度生长以富集抗体，约5 d后，待培养液变酸（变黄色）后，取细胞培养液，1 500×g离心10 min，收集上清，按1∶100稀释，采用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒检测McAb 1K19 亚型。上清经0.22 μm 滤膜过滤除菌。采用AKTA 纯化系统经Protein G纯化McAb 1K19，用0.1 mol／L Glycine-HCl（pH 2.7）缓冲液洗脱，进行12%SDS-PAGE分析。

1.8 方法的建立 用重组蛋白CPB1 包被96 孔板，100 μL／孔，4 ℃包被过夜；PBST洗涤液（含2‰Tween20的PBS）洗涤3次，每次5 min，用5%脱脂奶粉进行封闭；PBST洗涤3次，每次5 min，加入待检样品，同时设空白对照（PBS）及阴性对照（CPB2 单克隆抗体），100 μL／孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次，每次5 min，加入HRP 标记的羊抗鼠IgG，100 μL／孔，37 ℃孵育30 min；PBST 洗涤3次，每次5 min，加入OPD显色液，50 μL／孔，用2 mol／L H2SO4溶液终止反应，用酶标仪测定A450。

1.9 方法的优化

1.9.1 抗原包被浓度及抗体稀释度的确定 将重组蛋白CPB1用包被缓冲液（NaCO31.59 g，NaHCO32.93 g，ddH2O 100 mL，pH 9.6）稀释为2、5、8、10 μg／mL，包被96 孔板；用5%脱脂奶粉于37 ℃封闭30 min；以McAb 1K19作为一抗，用包被缓冲液分别进行1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096、1∶8 192、1∶16 384 稀释，加入96 孔板；加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（1∶2 000稀释）；其他步骤同1.8项。

1.9.2 二抗稀释度的确定 用最佳抗原包被浓度的重组蛋白CPB1包被96孔板，用5%脱脂奶粉于37 ℃封闭30 min；加入最佳稀释度的McAb 1K19；将HRP标记的山羊抗小鼠IgG按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000 进行梯度稀释，加入96 孔板；其他步骤同1.8项。

1.9.3 封闭时间的确定 用最佳抗原包被量包被96孔板，以5%脱脂奶粉为封闭液，分别孵育30、60、90和120 min；加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（1∶2 000 稀释）；其他步骤同1.8项。

1.10 临界值的确定 采用建立方法检测21 株阴性抗体（21 株CPB2 杂交瘤细胞株），计算样品的A450平均值（）和标准方差（SD），当A450≥+3SD时，判定为阳性；A450≤+ 2SD时，判定为阴性，介于二者之间时，判为疑似。

1.11 方法的验证

1.11.1 特异性 分别以C.p.A 型菌（ATCC 3624 和57-1）、C.p.B型菌（58-2）、C.p.C型菌（59-2和59-44）的培养液和E.coli（C83529、C83905、C83684、C83922、C14208）、单核细胞增生李斯特菌（ATCC19115）、沙门菌（CMCC50115）、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌的菌体培养物包被抗原，以McAb 1K19作为一抗，PBS为空白对照，CPB2单克隆抗体为阴性对照，对McAb 1K19进行特异性检测，通过临界值判定其特异性。

1.11.2 灵敏度 将McAb 1K19 按1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096、1∶8 192、1∶16 384、1∶32 768 稀释，采用建立的方法进行检测，以临界值为判定依据，A450对应的最大稀释倍数为该方法的灵敏度。

1.11.3 精密性 制备4 批重组蛋白CPB1，取同批重组蛋白CPB1，采用建立的方法对McAb 1K19 重复检测4 次，计算变异系数（CV）；取4 批重组蛋白CPB1，采用建立的方法对McAb 1K19 进行检测，计算CV。

1.12 方法的应用 采用建立的方法检测201 份正常牛血清及阳性小鼠血清和阴性小鼠血清样品，计算阳、阴性检出符合率及总体符合率。

2 结果

2.1cpb1基因扩增产物的鉴定cpb1基因PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1 000 bp 的目的基因条带，大小与预期相符，见图1。

图1 cpb1基因PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of cpb1 gene

2.2 重组质粒的鉴定 重组质粒pET32a-cpb1酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，EcoRⅠ单酶切产物可见约6 800 bp 的基因片段，NcoⅠ和EcoRⅠ双酶切产物可见950和5 900 bp的基因片段，NcoⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ三酶切产物可见500（该条带为cpb1基因在442 bp 处Hind 酶切位点断裂后形成的混合物）和5 900 bp 的基因条带，大小均与理论值相符，见图2。测序结果表明，获得的基因序列与GenBank 中登录的cpb1基因序列（X83275.1）的同源性为100%。上述结果表明，重组质粒pET32a-cpb1构建正确。

图2 重组质粒pET32a-cpb1的酶切鉴定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pET32a-cpb1

2.3 重组蛋白的鉴定 诱导菌超声破碎裂解沉淀和全菌体经12% SDS-PAGE 分析，表达的蛋白相对分子质量为54 000（CPB1 蛋白与硫氧化还原蛋白的融合蛋白）及34 000（CPB1 蛋白）条带，大小与理论值相符，上清中表达较少，主要以包涵体形式表达。见图3。

图3 表达的重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression product of recombinant protein

2.4 McAb 1K19 的鉴定 McAb 1K19 纯化产物经12%SDS-PAGE分析，可见相对分子质量约50 000的重链蛋白条带和25 000 的轻链条带，见图4。McAb 1K19 细胞株分泌的抗体重链为IgG2b 型，轻链为κ型。

图4 McAb 1K19纯化产物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified product of McAb 1K19

2.5 方法的优化

2.5.1 最佳抗原包被浓度及抗体稀释度 当重组蛋白CPB1 包被浓度为10 μg／mL，McAb 1K19 稀释度为1∶16 384 时，P／N 最大，为18.938，见图5。因此，确定CPB1 最佳包被浓度为10 μg／mL，McAb 1K19最佳稀释度为1∶16 384。

图5 抗原包被浓度（A）及抗体稀释度（B）的优化结果Fig.5 Optimization results of coating concentration of antigen（A）and antibody dilution（B）

2.5.2 最佳二抗稀释度 HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 稀释倍数为1∶1 000 时，P／N 最大，且A450接近1，见图6。因此，确定HRP标记的山羊抗小鼠IgG 最佳稀释倍数为1∶1 000。

图6 二抗稀释度的优化结果Fig.6 Optimization result of dilution of the secondary antibody

2.5.3 最佳封闭时间 5%脱脂奶粉封闭120 min时，A450和P／N 均最大，见图7。因此确定最佳封闭时间为120 min。

图7 封闭时间的优化结果Fig.7 Optimization result of blocking time

2.6 临界值的确定 21 份阴性对照的A450分别为0.073、0.076、0.064、0.071、0.083、0.063、0.088、0.066、0.059、0.077、0.091、0.072、0.155、0.109、0.064、0.135、0.068、0.119、0.066、0.134、0.072，x为0.086，SD为0.028。样品A450≥0.17判为阳性，≤0.142判为为阴性。

2.7 方法的验证

2.7.1 特异性 除C.p.B 型和C 型菌株外，其他菌株A450均＜0.142，见图8。表明McAb 1K19与其他病原菌无交叉反应。

图8 McAb1K19与常见食源性病原菌的交叉免疫反应Fig.8 Cross-immune reaction of McAb1K19 with common foodborne pathogenic bacteria

2.7.2 灵敏度 当McAb 1K19 稀释度为1∶32 768，即浓度为0.002 μg／μL时，A450为0.223 5，仍大于阳性临界值，且P／N 为10.2，见图9。表明建立的方法具有较高灵敏度。

图9 灵敏度验证结果Fig.9 Verification of sensitivity

2.7.3 精密性 用同批重组蛋白重复4次检测McAb 1K19 的A450分别为1.100、1.186、1.093、1.172，x为1.138，SD为0.041，CV为3.654%。用4 批重组蛋白检测McAb 1K19 的A450分别为1.115、1.259、1.063、1.220，x为1.164，SD为0.078，CV为6.759%。CV均＜10%，表明该方法具有良好的精密性。

2.8 方法的应用 201份健康牛血清及2份阴性小鼠均为阴性，2份阳性小鼠血清均为阳性，阴性、阳性及总符合率均为100%，表明建立的方法可用于临床样品检测。

3 讨 论

B 和C 型C.p.是患病家畜中常见的致病菌株，除分泌CPB1 外，还可分泌产生CPA、CPB2 等其他毒素和酶类［12-13］。天然CPB1 的分离纯化过程复杂繁琐，得率较低、成本高，不适合作为检测用抗原。目前，E.coli是最常用且最成熟的异源蛋白表达系统之一。本课题组前期从B 型C.p.菌株NCTC8533 中扩增获得cpb1基因，测序并克隆至pBET7 载体上，在E.coliM109 中表达，获得的目的蛋白相对分子质量约34 000，可与天然CPB1 产生的抗体发生特异性反应［14］。另一项研究将CPB1 的编码基因亚克隆至载体pAE 中，在E.coliBL21（DE3）中也成功表达了重组CPB1 蛋白［15］。本实验通过低温诱导方法获得了CPB1 表达，主要以包涵体形式存在。本课题组前期构建了重组表达质粒pTIG-Trx-cpb1，获得目的蛋白相对分子质量约34 000，但E.coli菌体蛋白的相对分子质量约35 000，两者较接近，使SDS-PAGE 分析结果难以区分，因此本实验将cpb1基因构建至载体pET32a，获得了相对分子质量为54 000 的重组蛋白CPB1 与硫氧化还原蛋白的融合蛋白，可与E.coli菌体蛋白进行有效区分。

ELISA法可特异性检测肠道内容物中的外毒素ε，是诊断C.p.感染的最佳方法之一［16］，如LAVANA等［17］以15 只美利奴羔羊为研究对象，在羔羊十二指肠内接种D型C.p.上清培养物300 mL，发现外毒素ε在回肠、十二指肠和结肠的检出率分别为92%、64%和57%，在7%的心包和房水液中也检测到了外毒素ε，但在腹水和尿液中未检测到该毒素；也有研究表明，在常规体液中检测外毒素ε存在较大误差，还应基于临床和病理数据诊断C.p.感染［18］。另外，KIRCANSKI等［19］通过重组CPB2 多克隆抗体建立了定量检测新生仔猪肠道内容物中CPB2 的抗原捕获ELISA 法；MCCOURT 等［20］建立了用于检测C.p.外毒素α 的夹心ELISA 方法。这两种方法为动物坏死性肠炎的快速筛查诊断提供了一种较理想的检测方法。

本研究通过制备重组CPB1，以其为包被抗原建立了CPB1抗体的间接ELISA检测方法，并采用C.p.的McAb 1K19对建立的方法进行优化和验证。优化结果表明，重组蛋白CPB1最佳包被抗原浓度为10 μg／mL，一抗最佳稀释度为1∶16 384，二抗最佳稀释度为1∶1 000，最佳封闭时间为120 min。方法验证结果显示，除B 和C 型C.p.外，其他常见食源性致病菌A值均低于0.3，表明McAb 1K19 具有良好的特异性；批内及批间CV均＜10%，表明建立的间接ELISA 法具有良好的精密性；方法的灵敏性较高。采用建立的间接ELISA 法对采自宁夏地区某养殖场的201 份健康牛血清、2 份C.p.阳性小鼠血清和小鼠阴性血清的检测结果表明，201份牛血清样品及小鼠阴性血清均呈阴性，阳性小鼠血清样品呈阳性，阴性、阳性及总符合率均为100%。

综上所述，本研究建立了一种用于CPB1抗体检测的间接ELISA 法，且具有良好的精密性和较高的灵敏性，可用于大量临床样本的检测。