防治新型冠状病毒肺炎纳米制剂的研究进展

张盈璐，陆泽华综述，张培霞，高瑜审校

福州大学化学学院肿瘤转移的预警和预防研究所 福建省肿瘤转移药物干预重点实验室，福建 福州 350108

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）是继SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）之后被发现的第3 种对人类具有高致病性的冠状病毒。由于其极强的传染性和极广的传播范围，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）在2020年3月11日正式将SARS-CoV-2 引起的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）疫情定性为大流行［1］。根据WHO 2022年6月20日发布的数据，全球累计COVID-19 确诊病例超过5.36 亿，死亡病例超过631 万［2］。因此，亟需开发用于预防和治疗COVID-19的药物制剂。

纳米技术在预防和治疗病毒感染中起着不可估量的作用。如在口罩表面附着石墨烯纳米材料，可利用太阳光产生光热效应达到灭菌效果［3］；用纳米技术制备疫苗，纳米材料既能传递抗原还可用作佐剂；在治疗方面，包载药物的纳米粒子可通过调控形状、尺寸等影响与病毒的作用方式，从而提高与病毒的相互作用效率。

本文对纳米技术在制备COVID-19 疫苗和治疗药物制剂方面的应用作一综述，在“疫苗+药物”的大框架下探讨纳米技术在控制COVID-19 大流行方面的潜力。

1 COVID-19的流行病学和发病机制

SARS-CoV-2 经人与人之间的接触或飞沫传播［4］，感染该病毒所导致的男女死亡率为2.4∶1，中位死亡年龄为70.3岁［5］。从出现症状至死亡的中位时间为14 d，平均潜伏期为5.2 d，但在70 岁以下患者中，潜伏期可长达20 d。与年轻人相比，老年人的感染风险更高。此外，SARS-CoV-2 还会诱发其他慢性疾病，如糖尿病、心血管疾病和高血压等［5］。

SARS-CoV-2 是一种单链RNA 病毒，长度为29 903 bp，直径为50 ～150 nm［6］，外观呈球形、椭圆形或多形形态，基因组可编码刺突（S）、包膜（E）、基质（M）和核衣壳（N）4 种结构蛋白。其与人类SARSCoV 基因组的查询覆盖率超过98%，具有80.26%的序列同一性。随着感染人数的增加，出现了大量SARS-CoV-2 的变异株，其中有5 种快速传播的毒株被指定为“受关注突变体”（variants of concern，VOC），包括α（B.1.1.7）、β（B.1.351）、γ（P.1）、δ（B.1.617.2）和Omicron（B.1.1.529）变异。SARS-CoV-2 通过与血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受体结合进入宿主细胞，当SARS-CoV-2 与ACE2 受体结合后，跨膜蛋白酶丝氨酸2（transmembrane serine proteinase 2，TMPRSS2）开始在S 蛋白的第1个蛋白质水解位点进行切割，形成S1和S2亚基。远端S1 亚基含有受体结合部位（receptor binding domain，RBD），在受体的识别和结合中发挥作用，而锚定的S2 亚基介导病毒与宿主细胞膜的融合。ACE2受体在肺、食道上皮细胞、回肠和结肠的肠上皮细胞以及肾小管中高表达，因此，呼吸道和消化道是感染的潜在入口［7］。

2 纳米技术在制备COVID-19疫苗中的应用

2.1 疫苗的免疫学基础 人体与病原体接触后，可产生非特异性免疫反应和特异性免疫反应。特异性免疫反应分为T 淋巴细胞引起的细胞免疫反应和B淋巴细胞引起的体液免疫反应。当感染病原体的细胞提呈病原体抗原给淋巴细胞后，淋巴细胞的辅助T细胞（T helper cells）被激活，刺激B 淋巴细胞分化产生抗体，并诱导细胞毒性T 细胞的生成，清除病原体。在免疫过程中同时可刺激产生记忆B 细胞和记忆T 细胞，当病原体再次入侵时，记忆淋巴细胞即刻识别病原体，产生抗体和细胞毒性T 细胞将病原体清除。机体的免疫响应受多种因素影响，如性别、年龄、怀孕与否和感染途径等［8］。

在SARS-CoV-2 感染宿主细胞过程中，S 蛋白尤其是RBD位点是其诱导特异性免疫应答的主要抗原部位，因此，全球现阶段主要以S 蛋白为目标设计开发COVID-19 疫苗。接种疫苗并不能保证接种者不会被感染，但大规模的疫苗注射覆盖率是形成群体免疫、消灭新冠的最佳途径。有研究显示，接种COVID-19 疫苗BNT162b2 加强针用于预防COVID-19的绝对有效性在97%～99%，且在10周内其效力不减弱［9］。根据技术路线和生产工艺，COVID-19 疫苗可分为灭活疫苗、减毒活疫苗、蛋白亚单位疫苗、病毒载体疫苗（复制／非复制）、病毒样颗粒疫苗和核酸疫苗，见图1。

图1 预防SARS-CoV-2的疫苗类型Fig.1 Types of vaccines against SARS-CoV-2

2.2 纳米技术在疫苗开发中的应用

纳米技术在开发对抗各种病原体（包括SARSCoV-2）疫苗方面受到广泛关注，这与纳米粒子自身特性密切相关。纳米粒子与病毒尺寸相近，具有高比表面，能更有效地刺激免疫系统；同时，纳米材料的疏水性可增强炎症介质和细胞因子的表达及释放［10-11］。近年来，相关学者在创新纳米疫苗配方（如脂质体、聚合纳米颗粒、病毒样颗粒等）方面做出了不懈努力。通常以包含金纳米颗粒、聚合物或蛋白质装配体为骨架，再将骨架与SARS-CoV-2 抗原（灭活或破坏的SARS-CoV-2）、表达某些SARS-CoV-2 蛋白的DNA 或特异性SARS-CoV-2 蛋白组成的活性成分缀合或偶联，制备出纳米疫苗，疗效往往优于非纳米配方的同类产品。有些不含抗原的纳米配方，如蛋白笼纳米颗粒也能发挥类似疫苗的作用，注射该纳米颗粒的小鼠能产生抗病毒抗体［12］。此外，纳米技术也被用于开发纳米佐剂增强抗原的靶向递送以及机体对抗原的特异性免疫应答，从而降低疫苗剂量［13］。以下详细介绍几类典型的纳米疫苗和佐剂。

2.2.1 核酸疫苗 核酸疫苗分为DNA 疫苗和RNA疫苗，通过使用宿主细胞的表达系统来合成抗原蛋白质，从而引发机体产生T 细胞免疫反应以及中和抗体反应［14］。使用病毒载体通常被认为是将核酸传递至细胞最有效的方法，但其应用常受到病毒载体免疫原性、生产和安全的限制［15］，因此，非病毒纳米递送系统成为当前研究的热点。

已在全球获批上市的BNT162b2 和mRNA-1273两种mRNA 疫苗，采用脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）作为递送载体［16］，编码的抗原均是两个脯氨酸突变修饰的SARS-CoV-2 全长刺突蛋白，以保留更多融合前的构象信息［17］。LNPs通常包括4种成分：阳离子或可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂以及聚乙二醇化脂质［16］，帮助BNT162b2 和mRNA-1273 两种疫苗达到了90%和94.1%的有效性［18］。这类疫苗产生的高滴度抗体对于SARS-CoV-2 毒株和新变体均相当有效，该效果与激活的滤泡辅助性T 细胞（T follicular helper cells，TFH）密切相关。TFH 在促进高亲和力抗体生成的同时，也在分化发展成记忆细胞［19］。

mRNA 疫苗在快速应对疫情大流行上作出了巨大贡献，但从稳定性和疫苗储存方面来说，DNA疫苗更胜一筹。除了已上市的ZyCoV-D，大多数新冠DNA疫苗尚在研发中。INO-4800 为美国INOVIO 生物制药公司开发的DNA 疫苗，其使用pGX9501 质粒编码SARS-CoV-2 刺突蛋白。通过CELLECTRA®设备发射的短暂电脉冲，质粒得以进入细胞产生有效的免疫反应［20］。

2.2.2 病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs） VLPs是一种由病毒衍生的结构蛋白和佐剂组成的衣壳［10］。VLPs 大小为20 ～300 nm，可被树突细胞或其他抗原提呈细胞有效识别。在病原体相关分子模式的帮助下，VLPs 有助于激活先天免疫应答，释放出Ⅰ型干扰素［21］。与必须在哺乳动物细胞系中制备的灭活或减毒病毒相比，VLPs 的优势是能在异种系统如细菌、酵母、昆虫细胞或植物中产生［22］。如NVXCoV2373 疫苗使用了杆状病毒／昆虫细胞平台，对症状性病例有89.7%的保护作用［23］。Medicago 公司开发的植物源VLPs 疫苗，是通过农杆菌介导的转化，将SARS-CoV-2 穗状基因序列导入本氏氮芥植株中并表达所需的抗原蛋白［24］。组装生产出的VLPs在大小和形状上与原SARS-CoV-2 病毒粒子非常相似。对于VLPs 生产平台的选择，需考虑所生产的VLPs 的结构、功能、可扩展性和生产过程的成本等要素。哺乳动物细胞是进行翻译后修饰和VLPs 正确组装的最佳平台，但所需生产成本较高［25］。

2.2.3 纳米佐剂 佐剂是用于激活先天免疫系统的药理学或免疫制剂，可使先天免疫系统对感染迅速作出反应，并刺激针对病毒感染的适应性免疫反应。其可有效地稳定抗原构象，促进抗原提呈细胞识别，进而增强免疫应答［26］。佐剂对疫苗的成功开发至关重要。Novavax重组蛋白疫苗中的Matrix M佐剂是由皂苷与胆固醇和磷脂组成的纳米颗粒制成，可增强辅助性T 细胞1（Th1）和Th2 反应，诱导多种亚类抗体，增强免疫细胞迁移，并节约抗原剂量［27］。ReCOV疫苗中添加了新型佐剂BFA03（一种类似于AS03 的角鲨烯佐剂），使家兔模型的免疫效果显著增强。此外，该疫苗采用了NTD-RBD-Foldon三聚体蛋白结构，与RBD 或N-末端结构域（N-terminal domain，NTD）组成的单一免疫原相比，增强了中和性抗体反应和降低病毒逃逸宿主免疫的可能性，同时对主要流行的病毒变异株具有很好的交叉免疫作用［28］。

3 纳米技术在制备治疗COVID-19 药物制剂中的应用

3.1 用于COVID-19 治疗的药物 在病毒迅速传播的背景下，药物再利用已成为治疗COVID-19的一线策略之一［29］。常见的用于抗SARS-CoV-2的药物及其作用机理见图2。瑞德西韦（Remdesivir）是一种腺苷类似物，其活性代谢物为瑞德西韦三磷酸。瑞德西韦三磷酸的结构与三磷酸腺苷（ATP）类似，可通过RNA聚合酶将其整合到新生病毒RNA上，从而导致复制过程中链的延迟终止，进而抑制病毒复制［30］。除瑞德西韦外，RNA聚合酶抑制剂还有法匹拉韦（Favipiravir）、莫那比拉韦（Molnupiravir）和AT-527［31］。

图2 SARS-CoV-2 感染宿主细胞增殖机制及各药物用于抗SARS-CoV-2作用机理Fig.2 Proliferation mechanism of SARS-CoV-2 in host cells and action mechanism of various drugs against SARS-COV-2

抗病毒药物不仅可作用于RNA，还可靶向病毒蛋白。阿比多尔（Umifenovir）是一种吲哚衍生小分子，可阻断S 蛋白与ACE2 受体结合，以抑制病毒融合到宿主细胞膜内［32］。抗逆转录病毒药物洛匹那韦（Lopinavir，LPV）和利托那韦（Ritonavir，RTV）作为针对主要蛋白酶（Mpro）的COVID-19 治疗药物被用于临床试验中［31］。但LPV／RTV 联合用药存在腹泻、恶心和肝损伤的副作用，且半衰期较短，因此可利用内源性细胞外囊泡的新配方提高蛋白酶抑制剂的安全性和有效性［33］。帕昔洛韦（Paxlovid）亦是一种治疗组合，由两种化合物PF-07，321，332（SARS-CoV-2 的3CL 蛋白酶抑制剂）和利托那韦（HIV-1 和HIV-2 蛋白酶抑制剂）组成。利托那韦同时也是细胞色素P4503A和CYP2D6的抑制剂，可减缓PF-07，321，332的体内代谢，降低给药剂量［30］。

3.2 用于COVID-19治疗药物递送的纳米载体

虽然药物再利用解决了临床亟需用药的需求，但随之带来的安全性和有效性挑战也不容忽视，如稳定性差，溶解度、膜通透性弱，生物利用度低等。一些研究人员从药物配方或药物传递方法入手，来解决已批准药物的物理化学、药代动力学或安全问题［33］。纳米技术能够促进药物递送系统的开发，减少药物的毒性并提高其功效，持续且有针对性地将药物输送至靶部位，见图3［34］，为应对传统药物疗法带来的挑战提供了新的思路。这可归功于纳米材料的特性：①表面电荷（可帮助药物通过细胞膜）；②颗粒小（使药物转移至易于诱发免疫的部位）；③表面积大（有助于药物有效载荷）；④内在抗病毒性（仿生特性）［35］。

图3 纳米技术用于制备治疗COVID-19 纳米制剂中的显著优势Fig.3 Significant advantages of nanotechnology used in development of nano-preparations for treatment of COVID-19

3.2.1 脂质纳米递送系统 脂质体是最早开发的纳米递送系统之一，大小通常在50 ～200 nm，是由单个或多个脂质双分子层组成的球形囊泡。这种独特的结构允许在水核中装载亲水药物，在脂质双分子层的酰基烃链中装载疏水药物，充分体现了脂质与药物组合的灵活性［18，36］。磷酸奥司他韦脂质体吸入粉剂展现了脂质体在肺部给药方面的优越性，并能降低给药频率［37］。由脂质材料制备的脂质纳米颗粒具有淋巴靶向的优点。将3 种逆转录病毒药物包括疏水性的LPV 和RTV 以及亲水性的替诺福韦（Tenofovir，TFV）转载入LNPs制备成纳米悬浮液，解决了口服组合药物在淋巴结处药物蓄积量不足的问题［38］。

3.2.2 聚合物纳米递送系统 聚合物纳米颗粒是一种有效的递送系统，可通过调节聚合物性质调整其功能［10，39］。通过与治疗性化合物结合，壳聚糖可增强聚合物纳米颗粒在黏膜环境中的持久性及对黏膜组织的渗透性［10］。瑞士Bioavanta-Bosti 公司公布的Novochizol™为一种壳聚糖纳米颗粒气溶胶配方，可用来靶向输送抗SARS-CoV-2 治疗药物至患者肺部［34］。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）也在新冠药物递送中被广泛应用。用PLGA 包裹LPV后再覆盖巨噬细胞膜，制成的药物递送系统显示出良好的抗炎和靶向抗病毒效果，可能对COVID-19具有综合治疗价值［40］。树枝状大分子也是药物或疫苗传递剂的优秀候选之一。将Remdesivir封装在聚乙二醇树枝状大分子中，药物溶解度可提高100 倍，并能在皮下给药后缓慢释药，与传统的静脉注射相比，减轻了门诊治疗和医疗系统的负担［34］。3.2.3 无机纳米颗粒 一些无机纳米颗粒显示出一定的抗病毒活性。纳米金能模拟病毒从而像病毒一样携带特殊蛋白质至机体，促使T 细胞明显增殖［41］。多孔硅纳米颗粒也已被证明对各种包膜和非包膜致病性人类病毒具有显著的抗病毒吸附（杀病毒）功效［42］。氧化石墨烯-银纳米粒子可阻断猫冠状病毒和包膜病毒进入细胞。另外，氧化铁纳米颗粒可与SARS-CoV-2 的S1-RBD 相互作用，亦是COVID-19 治疗的一种替代方案［43］。

3.2.4 细胞膜纳米囊泡 细胞外囊泡是一种异质性的膜纳米囊泡，能够阻断SARS-CoV-2 与宿主细胞的结合、中和细胞因子、减少炎症并改善COVID-19 治疗药物的传递［44］。有报道通过仿生合成技术开发了一种与天然蛋白质具有相同结构和活性的细胞膜纳米泡，因具有高水平的ACE2 和丰富的细胞因子受体，可作为与宿主细胞竞争病毒和细胞因子结合的纳米诱饵，从而抑制SARS-CoV-2 的复制和感染，并能有效结合和中和IL-6、GM-CSF 等炎性细胞因子［10］。通过膜水合方法制备的包含25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol，25-HC）和22十二烷基二甲基溴化铵（didodecyldimethylammonium bromide，DDAB）的纳米囊泡（25-HC@DDAB）可显著促进25-HC 介导细胞因子抑制和炎症相关信号下调［45］。

4 结论

COVID-19 已在全球范围内造成严重损失，迫切需要找到有效的解决方案来控制其大流行。纳米技术凭借其尺寸效应和免疫活性等特点，已被广泛应用于开发COVID-19 纳米疫苗和纳米药物，研发的BNT162b2 mRNA 疫苗即为纳米技术应用于疫苗领域的成功案例。在各国的共同努力下，会有更多更加安全有效的纳米制剂被开发出来，帮助人类战胜新病毒。