模拟振动后组分无细胞百白破联合疫苗的稳定性评价

蔡路奎，梁疆莉，李婧妍，李婉西，刘双芹，吴易梅，周建平，周健

中国医学科学院 北京协和医学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118

百日咳（pertussis）是一种主要由百日咳博德特菌（Bordetella pertussis）引起的高传染性呼吸道疾病，在未接种疫苗的婴儿中仍是致命的威胁。流行病学数据显示，近20年，百日咳在多个国家，甚至是疫苗高覆盖的国家出现了复发现象［1-3］，其防控形式依然严峻。接种疫苗是预防百日咳最有效的方法。自20世纪90年代，无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis，aP）由于其不良副作用较少，逐渐取代了全细胞百日咳疫苗（whole pertussis，wP）［4-5］。根据抗原纯化工艺的不同，aP 又分为共纯化疫苗和组分疫苗［6］，与共纯化疫苗比较，组分疫苗可更好地控制抗原成分组成、含量和质量［7-9］。目前，国际上已广泛应用以层析柱纯化aP 为基础的组分无细胞百白破联合疫苗（diphtheria，tetanus，and acellular component pertussis combined vaccine，DTacP），中国免疫规划中使用的百日咳疫苗为共纯化工艺制备的百日咳、白喉和破伤风联合疫苗（diphtheria，tetanus and acellular pertussis vaccine，DTaP），联合疫苗可减少接种剂次，提高接种依从性。有研究表明，DTacP较DTaP 安全性更好［6，10］。因此，本课题组前期采用层析柱纯化百日咳毒素（pertussis toxin，PT）、丝状血凝素（filamentous hemagglutinin，FHA）及黏附素（pertactin，PRN），以氢氧化铝佐剂吸附PT、FHA、PRN、白喉类毒素（diphtheria toxoid，DT）及破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT），制备的DTacP 质量和免疫效果均符合《中国药典》三部（2020 版）的要求［11-12］。

疫苗有效成分复杂，为确保疫苗安全、有效、稳定，WHO 及各国监管机构对疫苗的研发、生产、运输均有严格的监管要求。2015年中国发布的《生物制品稳定性研究技术指导原则》和2020年修订的《中国药典》三部（2020 版）“9402 生物制品稳定性试验指导原则”中均要求生物制品运输过程应进行相应的稳定性模拟验证研究［12-13］。稳定性研究的设计应模拟运输时的最差条件，需充分考虑运输路线、交通工具、距离、时间、振动频率和幅度等。本研究根据上述要求和方法，模拟DTacP 连续通过航空、铁路、公路运输过程，进行实验室随机振动试验，以评估DTacP 在最大模拟振动和持续时间下的稳定性，为该疫苗的质量控制、运输和使用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 疫苗 DTacP（批号：20190501、20190502、20190503）由中国医学科学院医学生物学研究所自主研制，其中DT 和TT 含量分别为12.5 和3.5 Lf／剂，PT、FHA和PRN含量分别为25、25、8 μg／剂。

1.2 主要试剂及仪器 PT、FHA、PRN ELISA 捕获抗体及HRP 标记的PT、FHA、PRN 抗体均购自中国食品药品检定研究院；单组分TMB 底物显色液购自北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯；Zeta 电位仪购自英国马尔文仪器有限公司；透射电子显微镜购自日本HITACHI 公司；吸合式电磁振动台购自广州市番禺凡正电磁振动机厂；酶标仪购自芬兰赛默飞世尔公司。

1.3 实验动物 SPF 级NIH 小鼠，3～8 周龄，雌雄各半，体质量10～18 g，购自中国医学科学院医学生物学研究所动物实验中心，动物生产许可证号为：SCXK（滇）K2019-0002。饲养于SPF 级实验动物房，动物使用许可证号为：SYXK（滇）K2019-0003。本实验对小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照动物伦理相关规定进行，动物伦理批准号为：医科生伦字［2016］57号。

1.4 模拟振动试验 取3 批DTacP（批号：20190501、20190502、20190503），根据国家标准“GB／T 4857.23-2012 包装运输包装件基本试验第23 部分：随机振动试验方法”［14］，模拟疫苗连续通过公路运输7 d，铁路运输3 d，航空运输12 h，采用吸合式电磁振动台进行实验室随机振动试验。首先模拟公路运输，设置低频4 Hz 振动63.2 min，高频16 Hz 振动3.9 min，根据时间折算系数计算相当于公路运输7 d；其次模拟铁路运输，设置低频2 Hz 振动13.8 min，高频50 Hz振动0.03 min，根据时间折算系数计算相当于铁路运输3 d；最后模拟航空运输，设置低频12 Hz 振动0.66 min，高频100 Hz 振动0.17 min，根据时间折算系数计算相当于航空运输0.5 d。振动仪参数设置见表1。通过6 种振动时间的叠加，获得最大模拟振动和持续时间下的疫苗样品。

表1 随机振动试验参数Tab.1 Parameters of random vibration test

1.5 疫苗稳定性评价

1.5.1 上清中抗原含量的测定 将振动前后3 批DTacP 样品，按照《中国药典》三部（2020 版）通则3417酶联免疫吸附法检测疫苗上清中PT、FHA、PRN的抗原含量［12，15］；按照《中国药典》三部（2020 版）通则3506絮状试验检测上清中DT、TT絮状反应［12］。

1.5.2 Zeta电位测定 将振动前后3 批DTacP 样品，采用Zeta电位仪测定疫苗的Zeta电位。

1.5.3 电镜观察 将振动前后3 批DTacP 样品，采用透射电子显微镜（加速电压80 kV）观察疫苗佐剂吸附结构。

1.5.4 效价的测定 将振动前后3 批DTacP 样品，按照《中国药典》三部（2020版）“吸附百白破联合疫苗”中附录2 方法测定百日咳疫苗效价，按通则3505 方法测定白喉疫苗效价，按通则3504 方法测定破伤风疫苗效价［12］。

1.5.5 其他项目检测 取振动前后3 批DTacP 样品，根据《中国药典》三部（2020 版）“吸附百白破联合疫苗”中的要求和方法，对样品进行鉴别试验、物理检查（外观、装量、渗透压摩尔浓度）、化学检定（pH、铝含量、游离甲醛含量）、无菌检查、特异性毒性检查及毒性逆转试验［12］。

1.6 统计学分析 应用GraphPad Prism 7 软件进行统计学分析和绘图，振动前后DTacP样品检测结果的比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 上清中的抗原含量 振动后，3 批DTacP 上清中PT、FHA、PRN 抗原含量均值分别为2.08、1.61、0.69 μg／剂，与振动前比较，差异均无统计学意义（t=0.16～1.73，P均＞0.05），见表2；振动前、后均未检测出DT、TT的絮状反应。

表2 DTacP振动前后上清中抗原含量（μg／剂）Tab.2 Antigen content in supernatant of DTacP before and after vibration（μg／dose）

2.2 Zeta 电位 振动前后，3 批DTacP 的表面电位均为负值，均值分别为-7.00 和-7.75 mV，差异无统计学意义（t=0.40，P＞0.05），见图1。

图1 振动前后DTacP的Zeta电位Fig.1 Zeta potential of DTacP before and after vibration

2.3 电镜观察 振动前后的DTacP 均呈聚集性，晶体大小变化较小，聚集性无明显改变，见图2。表明振动对氢氧化铝佐剂与抗原吸附结构无明显影响。

图2 振动前后DTacP的电镜图（×20 000）Fig.2 Electron microscopy of DTacP before and after vibration（×20 000）

2.4 效价 模拟振动后，3批DTacP中的百日咳、白喉、破伤风疫苗效价均值分别为6.03、35.70、42.50 IU／剂，与振动前比较，差异均无统计学意义（t= 0.37～0.97，P均＞0.05），见表3。

表3 DTacP振动前后的效价（IU／剂）Tab.3 Titers of DTacP before and after vibration（IU／dose）

2.5 其他检测结果 振动前后，3 批DTacP 均为均匀乳白色混悬液，无异物，预灌封注射器外观完好无破损；装量、鉴别试验、无菌检查、特异性毒性检查、毒性逆转试验均未见明显变化；pH、氢氧化铝含量、游离甲醛含量、渗透压均值差异均无统计学意义（t=0.48～1.06，P均＞0.05）。见表4。

表4 DTacP振动前后的其他项目检测值Tab.4 Values of other indicators of DTacP before and after vibration

3 讨 论

我国面积广阔，地形复杂，疫苗可能需经过飞机、火车和汽车多种方式运输，不同的运输方式产生的振动对疫苗包装及疫苗制品形态的影响均未知，因此，上市前对疫苗进行模拟振动稳定性研究尤为重要。本研究模拟疫苗连续通过航空运输12 h，铁路运输3 d，公路运输7 d 的过程，其中任何一种运输方式的模拟时间均足以满足从疫苗生产厂家配送至国内各使用点。为研究最大振动和持续时间对疫苗稳定性的影响，本研究选择了疫苗运输的最差情况，即疫苗连续在上述3 种运输条件下运输，并依据国家标准“GB／T 4857.23-2012 包装运输包装件基本试验第23部分：随机振动试验方法”中3种运输方式的振动频率［14］，选择其中最具代表性的频率进行实验室模拟振动试验。根据振动原理，振动强度与振幅和时间相关，提高振幅缩短时间以模拟与原振动强度相同的振动效果［16-18］。

考虑振动对疫苗包装密封性可能产生影响，本研究对振动前后3 批DTacP 进行物理检查和无菌检查，结果显示，振动后疫苗样品的外观、装量、渗透压摩尔浓度、无菌检查均符合《中国药典》三部（2020版）［12］的质量标准，与振动前比较变化较小，表明振动对DTacP 的包装密封性无影响。振动还有可能影响疫苗的抗原稳定性，从而影响疫苗的免疫效果。本研究进行了Zeta 电位测定、上清中抗原测定和电镜观察。Zeta电位是悬浮物稳定性的重要指标［19-20］，Zeta 电位的绝对值越大，则体系越稳定，反之，颗粒物越倾向于聚集，则体系越不稳定［21］。本研究检测结果表明，振动前后DTacP 的Zeta 电位差异无统计学意义（P＞0.05）。上清中抗原测定结果可评估振动对疫苗抗原与佐剂的吸附情况，检测结果表明，振动前后上清中抗原含量差异均无统计学意义（P＞0.05），表明振动未引起明显的解吸附现象。电镜可观察到疫苗佐剂结构，经电镜观察振动前后样品，未见明显的结构改变，提示振动对DTacP 联合疫苗的佐剂结构无明显影响。为考察疫苗的免疫效果，本实验评估了振动前后3 批疫苗的效价，结果显示，振动后3 批联合疫苗中的百日咳、白喉、破伤风疫苗效价均符合《中国药典》三部（2020 版）的质量标准［12］，与振动前比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示振动对DTacP的免疫效果无影响。

疫苗的运输稳定性研究是一个系统且复杂的研究过程，本研究仅评估了DTacP 在实验室模拟振动条件下的稳定性，后续还需综合考虑运输过程中潜在的温度偏移和其他环境因素，模拟真实的运输环境，进一步客观、全面评价DTacP 的运输稳定性，为该疫苗的质量控制、使用和贮存提供数据支持。