外泌体在上皮性卵巢癌中的研究进展

董 健，翟梁好，吕小慧，陈必良

（空军军医大学第一附属医院，西京 医院妇产科，陕西 西安 710032）

卵巢癌是现代女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，是全世界范围内导致女性妇科肿瘤死亡的第二大主要原因[1]，由于其早期缺乏典型的临床表现和有效的诊断方法，大多数患者就诊时已为晚期。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是卵巢恶性肿瘤中最常见的病理类型，占所有病例的90%[2]，且发病率在我国妇科肿瘤中呈上升趋势[3]。目前EOC 在临床中的主要治疗手段是进行彻底的肿瘤细胞减灭术辅以紫杉醇联合铂类为基础的化疗治疗，近年来随着手术技术的不断改进，化疗药物及靶向药物、免疫治疗的迅速进展，EOC 的生存率有了较大的提高，但其5 年存活率仍徘徊在40%左右，呈隐匿性发展，增殖转移能力强，易耐药，以上都是导致EOC 预后差的原因。因此，探寻EOC 高灵敏度、高特异性的生物标志物，对实现早期诊断，探究EOC 增殖转移、化疗耐药的作用机制并针对化疗耐药等制定靶向治疗至关重要。

1 外泌体的生物学功能

外泌体最初被认为是细胞排泄废物的一种形式，随着实验研究的推进，外泌体的结构和功能不断得到阐明，现已证明其是细胞间通讯、信息交换和肿瘤发展的重要媒介。外泌体是大小为30～150nm 的胞外囊泡，不同于直接从膜上分离出来的胞外囊泡，外泌体主要通过核内体途径形成，并可由多种类型的活细胞分泌，在血液、腹水、尿液、卵泡液、精液、羊水等体液中均可发现[4]。外泌体富含蛋白质、核酸和脂质，其内含有的多种特异性蛋白质、DNA、mRNA、微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）及环状RNA（cirRNA）等取决于亲本细胞的类型和环境条件，他们可以通过改变受体细胞的基因表达、细胞膜结构、信号通路进而影响受体细胞的功能和表型，表明不同来源的外泌体可能发挥着各自独特的功能。越来越多的研究表明，外泌体输送的生物活性分子，通过与受体细胞融合或与细胞表面的受体结合参与运输、细胞间通讯、信号转导、抗原呈递和免疫调节，在细胞间相互联系中起着关键作用[5]。

外泌体的内容物因受到磷脂双分子层的保护而高度稳定，通过现有技术对体液中的外泌体进行检测，其基因组、蛋白质组可以反映原始细胞的基因和蛋白质。已有研究证明，正常人类血液中外泌体的含量约2 000 万亿个，肿瘤患者血液中约含有4 000 万亿个外泌体[6-7]，肿瘤细胞比正常细胞分泌更多的外泌体已经获得认可，且肿瘤细胞外泌体内容物比正常细胞更具有标志性，通过旁分泌和远距离分泌与靶细胞融合，其介导的细胞间信息和物质交流可以为恶性肿瘤的发生发展提供必要的条件，影响肿瘤的侵袭、转移和治疗效果。因此，外泌体被认为是早期识别肿瘤发生发展的新的生物标志物，其特殊的生物学功能可提高生物标记物扩增的灵敏度，进而提高肿瘤早期诊断的阳性率。

2 外泌体内容物在EOC 中的作用

目前晚期EOC 主要通过临床表现、影像学检查结合病理检查确诊，用于EOC 诊断和预后的生物标志物是血清肿瘤标志物糖类抗原（CA125），但其敏感性和特异性较低，并不是所有的患者CA125 都升高，如炎症性病变也会导致CA125 的升高。外泌体的出现为EOC 的早期诊断提供了新思路，最新的研究表明，在EOC 患者血液、腹水及尿液中均检测到了高浓度的外泌体，并随着肿瘤的侵袭转移而增多，因此外泌体及其内容物具有成为EOC 诊断和判断预后的重要标志物潜在特征[8-9]。

2.1 外泌体蛋白质

外泌体中的蛋白质因受到磷脂双分子层保护较为丰富稳定，动态波动较小，通过对EOC 外泌体中的蛋白质进行蛋白组学分析，更容易从外泌体中发现和确认生物标志物[10]。诸多研究对不同体液来源的EOC 外泌体进行了蛋白质组学分析，揭示了相关功能蛋白质的差异性聚集[11]。Dorayappan 等[12]通过使用不同的技术提取纯化外泌体，对高级别浆液性卵巢癌细胞株及其起源细胞系鉴定了EOC 的蛋白标志物，确定了20 个独特的外泌体蛋白作为优先级候选蛋白生物标记物，如肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、信号传导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription-3，STAT3）、基质金属蛋白酶7（matrix metalloproteinase-7，MMP7）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）等，通过良性肿瘤和不同期别EOC 对比分析，发现早期EOC 患者血清外泌体中的HGF、STAT3 和IL-6 水平显著升高。Zhang 等[13]使用自制的3D 纳米微流体芯片，检测了20 例EOC 患者血浆中CD24、上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和叶酸受体α 蛋白的表达变化，其中叶酸受体α 蛋白是一种糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白，其主要功能是介导叶酸向细胞内运输。在正常组织中的叶酸受体α 蛋白表达受限，但在多种实体肿瘤中均有上调表达，对卵巢癌患者血液中外泌体检测发现叶酸受体α 蛋白含量显著升高，有助于早期EOC 的发现，可作为无创检测手段对EOC 进行早期诊断。

新技术的不断发展为分析EOC 外泌体中的蛋白质组图谱提供了技术支持，外泌体的生物学特性研究发现，不同肿瘤细胞的不同阶段可分泌特异性蛋白质，通过EOC 外泌体蛋白质组图谱与其他肿瘤细胞的对比研究，发现EOC 特异性蛋白分子，这些蛋白分子可以作为EOC 的“二维码”，用于开发早期诊断标志物[14]。Skryabin 等[15]研究表明多种上皮性癌细胞（非小细胞肺癌、乳腺和卵巢癌细胞）产生的外泌体及肿瘤患者体液中提取的外泌体均存在人类红细胞膜整合蛋白（stomatin），且不同癌种来源的外泌体中stomatin 的丰度不同，EOC 细胞外泌体中stomatin表达较高，使其有望成为很有前途的外泌体标记物。

2.2 外泌体微小RNA

微小RNA（miRNA）是外泌体中含量最丰富的非编码小RNA，与血清、血浆等体液循环miRNA 相比，因其在外泌体中免受RNA 酶的降解，且其含量随着肿瘤的进展而发生变化，在多种生理病理过程中发挥重要作用，在各种癌症细胞分泌的外泌体中可以发现表达差异的miRNA，外泌体中miRNA 水平的变化对鉴别良恶性肿瘤及肿瘤分期预后有一定的诊断价值[16]。

EOC 分泌的外泌体中，存在许多针对mRNA 的特定基因伴随肿瘤发生发展的全过程，众多研究报道，miR-203、miR-213-3p、miR-31、miR-373、miR-21-5p、miR-141-3p 和miR-200a/b/c 等参与EOC的发生发展并发挥了重要作用[17-19]。Yoshimura等[20]发现EOC 患者血清外泌体中miR-99a-5p 表达水平显著增加，检测EOC 的敏感性和特异性分别为0.85 和0.75，且术后血清miR-99a-5p 表达水平显著下降，同时，人腹膜间皮细胞经EOC 来源的外泌体处理后，miR-99a-5p、纤维连接蛋白和玻璃体连接蛋白的表达显著增加，促进了EOC 的侵袭转移，提示外泌体中miR-99a-5p 一定程度上可反映EOC 肿瘤负荷及病程进展。Wang 等[21]发现外泌体miR-205 表达上调，EOC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强，凋亡能力减弱，可用来评价EOC 的恶性程度。Hang 等[22]利用基因芯片技术检测了卵巢癌细胞及其外泌体的miRNA 表达谱，发现共有22 个miRNAs 在外泌体及其来源的卵巢癌细胞中共表达，其中miR-145-5p 及其负性调控的靶基因CTGF，可能通过影响Hippo 信号通路参与卵巢癌患者的预后。

3 外泌体参与EOC 的转移

EOC 发生广泛转移是其预后差的重要因素，因此，预测、防范及阻止肿瘤转移扩散是治疗的关键策略[23]。近年的研究发现肿瘤细胞衍生的外泌体可以在转移靶器官中建立肿瘤微环境，通过为肿瘤细胞提供物质基础促进转移。基质细胞、细胞外基质和外泌体构成了肿瘤微环境，其中外泌体是肿瘤细胞与微环境之间的一种强大的信号媒介，促进所有相关细胞与肿瘤细胞的沟通。EOC 外泌体可以通过免疫抑制、血管生成、基质细胞重塑和致癌基因重组等方式促进转移前微环境的形成[8,24-27]。

外泌体整合素在肿瘤微环境的建立中起了关键性作用，可用来预测器官特异性转移，肿瘤患者血清中提取的外泌体整合素表达谱可作为预测未来转移部位的预后因子[28-30]，已有研究证明外泌体蛋白质组学显示出不同的整合素表达模式，其中外泌体整合素α6β4 和α6β1 与肺转移相关，而外泌体整合素αvβ5 与肝转移相关，通过靶向敲低整合素α6β4 和αvβ5 表达可减少转移部位对肿瘤细胞外泌体的摄取，起到降低肺转移、肝转移的作用[28]。Li 等[31]研究证明了EOC 衍生的外泌体整合素α5β1(ITGA5B1)的表达及其与天冬酰胺内肽酶(AEP)在人腹膜间皮细胞中的作用和机制，发现ITGA5B1/AEP 复合体在EOC 细胞中高表达，EOC 细胞分泌的ITGA5B1/AEP 复合体对肿瘤细胞在腹膜间质细胞中的增殖和迁移中起重要作用，患者的血清和腹水中也存在高水平的外泌体ITGA5B1/AEP 复合体，同时发现肿瘤细胞外泌体ITGA5B1/AEP 复合体的表达与患者总生存期呈负相关，说明外泌体ITGA5B1/AEP 复合体在腹膜转移中起重要作用。这些研究都证实外泌体直接或间接参与到肿瘤微环境的构建，从而促进EOC 侵袭和广泛转移。

4 外泌体参与EOC 的化疗耐药

化疗耐药是EOC 治疗失败的主要原因之一，近50%的晚期EOC 患者因化疗耐药复发且发生远处转移，及时全面地认识不同患者的耐药机制，可以进一步完善个体治疗的方案。肿瘤细胞的耐药性机制十分复杂，涉及许多因素，如药物外排泵的过度表达、药物失活、DNA 错配修复机制及药物靶点的改变、突变。外泌体与化疗耐药的相关性为耐药机制的研究提供了新的方向，已发现外泌体不仅在诱导药物敏感癌细胞产生耐药性方面发挥着重要作用，还可以在肿瘤微环境中介导肿瘤细胞和间质细胞之间的相互联系，促进肿瘤进展和获得性化疗耐药[32-33]。

大量研究证明，肿瘤细胞可以通过内吞或释放含有致癌或抑制因子miRNA 的外泌体，促进肿瘤细胞化疗耐药[34-35]。Zhu 等[36]的研究证明低氧条件及相关分子可以诱导EOC 相关巨噬细胞M2 极化，上调巨噬细胞来源的外泌体miR-223 的表达水平，这些外泌体可以通过受体细胞内化方式，将miR-223转移到EOC 细胞中诱导受体细胞向化疗耐药表型转变，通过PTEN-PI3K/AKT 途径在体内和体外促进EOC 化疗耐药。化疗还可以诱导肿瘤细胞表达多耐药蛋白，并通过外泌体将耐药性传递给其他细胞。Wang 等[37]研究发现EOC 的化疗过程中，化疗药物不仅可以刺激多耐药蛋白ABCB1 在肿瘤细胞的表达，还可以通过失调Rab8B 和Rab5 蛋白诱导富含多耐药蛋白ABCB1 外泌体的分泌、循环和摄取，耐药外泌体被受体细胞摄取后，可以促进ABCB1 向质膜的再循环，帮助肿瘤细胞产生紧急化疗耐药。

外泌体除了促进肿瘤细胞产生获得性化疗耐药，还可以直接外排或隔离化疗药物，Safaei 等于2005 年研究发现外泌体可以将化疗药物从肿瘤细胞中移除，作为一种阻断机制使药物在肿瘤细胞内的积累量减少，通过降低其在肿瘤细胞内的有效浓度来降低化疗药物的杀伤作用，介导化疗耐药。

5 结语

近年来，外泌体在肿瘤中的广泛研究，随着敏感、快速的生物传感器的应用，其生物学特性不断被认识，外泌体及其内容物被认为是早期识别肿瘤的新的生物标志物，在发现肿瘤的发生发展中发挥重要作用。外泌体在EOC 的发生、早期诊断、侵袭转移、化疗耐药及判断预后中具有重要的研究价值，期望通过进一步深入研究，外泌体可以成为EOC 早期诊断、判断预后的重要标志物，为EOC 提供新的潜在特异性治疗靶点，为EOC 患者带来更多福音。