乙基伊维菌素高产菌株选育及其发酵工艺优化

李 冰, 齐 欢, 张成宏, 张绍勇,张立钦, 向文胜, 王继栋*,

(1. 湖州师范学院 生命科学学院 浙江省媒介生物学与病原控制重点实验室，浙江 湖州 313000；2. 东北农业大学 生命科学学院，哈尔滨 150030)

阿维菌素 (avermectin) 和米尔贝霉素 (milbemycin)是由微生物发酵产生的十六元大环内酯类高效低毒生物源杀虫剂，二者及其衍生物，如伊维菌素(ivermectin)、多拉菌素 (doramectin)、埃玛菌素(emamectin)、埃珀利诺菌素 (eprinomectin)、塞拉菌素 (selamectin) 和米尔贝肟 (mibemycin-oxime)、乐平霉素 (lepimectin)、莫西菌素 (moxidectin) 等[1-4]已在农林植物害虫[5-6]、害螨[7-8]与动物寄生虫[9-10]的防治中得到广泛应用，对保障农产品安全、畜牧业和医药健康发展具有重大意义。但是，由于害虫抗药性的产生[11-12]以及人们对低毒、高效、环境友好型药物的迫切需求，亟需研发新品种以满足社会的需要。

甲基伊维菌素(methyl ivermectins)和乙基伊维菌素 (ethyl ivermectins) (图式1)，亦称作天维菌素A/B (tenvermectins A/B)，是从组合生物合成构建的基因工程菌Streptomyces avermitilisAVEH39[13]和Streptomyces avermitilisMHJ1101[14]中获得的一种新型十六元大环内酯类抗生素，其对小菜蛾、黏虫、棉铃虫、松材线虫和朱砂叶螨的室内毒力比同类化合物更强[15]，而对大鼠和小鼠经口毒性明显小于阿维菌素，对斑马鱼、大型溞的毒性远低于阿维菌素[16]。在室内选育的小菜蛾中，抗甲基伊维菌素品系RS 品系仅与氯氰菊酯存在中等水平交互抗性，与乙基伊维菌素、阿维菌素B1a、氯虫苯甲酰胺和多杀菌素不存在交互抗性[17]。因此，甲基和乙基伊维菌素具有开发为新一代微生物源农药的潜力。

图式1 甲基伊维菌素和乙基伊维菌素结构式Scheme 1 The structural formula of methyl ivermectin and ethyl ivermectin

乙基伊维菌素对松材线虫和朱砂叶螨的活性高于甲基伊维菌素[18]。但是，上述两株基因工程菌主要产生甲基伊维菌素，乙基伊维菌素的产量较低[13-14]。高昂的制造成本严重制约了以乙基伊维菌素为主成分的新农药开发，如何提高乙基伊维菌素的产量成为该产品能否开发成功的关键影响因素。

本研究对S.avermitilisAVE-H39 进行诱变选育，以期筛选出乙基伊维菌素的高产菌株。通过单因素试验、Plackett-Burman 试验、最陡爬坡试验以及响应面优化试验，对乙基伊维菌素高产菌株的发酵培养基进行优化，以提高乙基伊维菌素的发酵单位。研究结果将为开发以乙基伊维菌素为主成分的新型十六元大环内酯农药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株和主要仪器

以StreptomycesavermitilisAVE-H39 为基因工程菌，由工业阿维菌素生产菌株中的阿维菌素PKS 的装载模块和部分延伸模块用米尔贝霉素PKS 的相应模块通过两步替换而获得，保藏于东北农业大学生命科学与生物技术研究中心。

ZXSD-R1270 恒温培养箱和ZWY-2112D 摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；ARTP-IIS诱变育种仪，无锡源清天木生物科技有限公司；L550 离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JP-060 超声仪，深圳洁盟清洗设备有限公司；50 L 发酵罐，上海保兴生物设备销售有限公司；Agilent 1260 HPLC 色谱仪，安捷伦科技公司；Zorbax SB-C18色谱柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)，安捷伦科技公司；ZF-7A 紫外分析仪 (254/365 nm)，骥辉分析仪器有限公司。

1.1.2 试剂及培养基 玉米淀粉和可溶性淀粉和麦芽糊精，上海源叶生物科技有限公司；甘露醇，青岛明月海藻集团有限公司；麦芽抽提物和琼脂，美国BD 公司；酵母抽提物，英国Oxoid公司；酵母粉，安琪酵母股份有限公司；棉籽饼粉、黄豆粉和花生饼粉，北京鸿润宝顺科技有限公司；CaCO3，山东优索华工科技有限公司；亚硝基胍，德国Sigma 公司；甲基磺酸乙酯，上海麦克林生化科技有限公司；蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司；葡萄糖、淀粉酶和蔗糖，国药集团化学试剂有限公司；甲醇和乙腈，均为色谱纯，美国TEDIA 公司。

固体培养基：葡萄糖4 g/L，酵母抽提物4 g/L，麦芽抽提物10 g/L，琼脂18 g/L，蒸馏水1 L，pH 7.0。

种子培养基：葡萄糖5 g/L，玉米淀粉20 g/L，黄豆粉10 g/L，酵母抽提物10 g/L，CaCO32 g/L，蒸馏水1 L，pH 7.0。

初始发酵培养基：玉米淀粉100 g/L，淀粉酶0.2 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黄豆粉20 g/L，蒸馏水1 L，CaCO33 g/L，pH 7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法 固体平板及斜面培养：取甘油管保藏的孢子悬浮液100 μL 均匀涂布于直径90 mm的固体平板上，置于28 ℃培养箱中培养7～10 d。

摇瓶发酵：刮取固体平板培养的孢子，接种于装有30 mL 种子培养基的250 mL 三角摇瓶中，于28 ℃、220 r/min 条件下培养48 h；移取1.5 mL转接至装有30 mL 发酵培养基的250 mL 三角摇瓶中，于28 ℃、220 r/min 条件下摇瓶发酵12 d，取样检测。

50 L 罐发酵：刮取斜面培养的孢子，接种于装有200 mL 种子培养基的1 000 mL 三角摇瓶中，于28 ℃、220 r/min 条件下培养48 h；转接至50 L 发酵罐中培养，接种量5% (V/V)，发酵罐装量30 L，在线监控培养。

1.2.2 高产菌株选育 分别通过紫外 (UV)、常压室温等离子体 (ARTP)、亚硝基胍 (NTG)、甲基磺酸乙酯 (EMS) 或复合诱变手段，对发酵菌株进行诱变选育。

孢子悬浮液：取生长7 d 的斜面培养物，刮取孢子至无菌水中，用双层纱布过滤制备孢子悬浮液，调整其浓度为107～108个/mL。

UV 诱变：取1 mL 孢子悬浮液，用功率30 W、波长254 nm 的紫外灯，距液面20 cm 处分别照射处理20、40、60 和80 s 后，计算各时长致死率和正突变率。

ARTP 诱变：取25 μL 孢子悬浮液，涂于载片上，设定气流量10SLM，入射功率100 W，流出口间距2 mm，分别处理30、40、50 和60 s 后，计算各时长致死率和正突变率。

NTG 诱变：对物理诱变处理耐受的菌株，按前述方法制备孢子悬浮液后，在28 ℃、220 r/min条件下，分别用质量浓度为500、1 000、1 500 和2 000 mg/L 的NTG 处理40 min 后，计算致死率和正突变率。

EMS 诱变：取1 mL 孢子悬浮液，在28 ℃、220 r/min 条件下，分别用浓度为0.2、0.3、0.4 和0.5 mol/L 的EMS 处理60 min 后，计算致死率和正突变率。

复合诱变：选择上述两种或者多种诱变方法，连续处理孢子悬浮液进行诱变，筛选乙基伊维菌素发酵效价提高的菌株。

1.2.3 发酵工艺优化 对诱变选育获得的高产突变菌株进行单因素试验、Plackett-Burman 试验筛选、最陡爬坡试验以及响应面法优化试验，以优化发酵工艺，进一步提高乙基伊维菌素的发酵效价。

单因素试验：1) 以初始发酵培养基为基础，氮源不变，分别考察葡萄糖、蔗糖、甘露醇等速效碳源和玉米淀粉 (添加0.02% 淀粉酶)、麦芽糊精、可溶性淀粉等迟效碳源，筛选最优碳源；2) 以初始发酵培养基为基础，碳源不变，分别考察酵母粉、酵母抽提物、蛋白胨等速效氮源和玉米浆干粉、棉籽饼粉、黄豆粉、花生饼粉等迟效氮源，筛选最优氮源；3) 以初始发酵培养基为基础，碳源和氮源不变，分别添加(NH4)2SO4、MgSO4、K2HPO4、NiCl2、CoCl2、FeSO4、MnSO4、ZnSO4等无机盐和微量元素，配合CaCO3，筛选最优无机盐和微量元素；然后对pH、接种量、摇瓶装量、摇床转速等进行单因素试验。本研究中所有试验均重复3 次，培养基中玉米淀粉默认添加0.2 g/kg 的淀粉酶。

Plackett-Burman 试验：在单因素试验的基础上，以乙基伊维菌素的发酵效价为响应值，采用三水平法比较各个因素之间的差异和整体的差异，对各因子的显著性进行排序，筛选出对产量有显著影响的因子[19]。

最陡爬坡试验：依据Plackett-Burman 试验结果分析，结合试验的实际需要，对显著因素设计最陡爬坡试验，包括各因素的变化幅度和方向，以期最快地逼近最大响应区域，获得较为理想的响应面试验的中心点。

响应面试验：根据爬坡试验结果的中心点进行Box-Behnken 中心组合试验设计[20-22]，采用三因素三水平进行试验，然后对数据进行统计分析。

数据分析：利用Design-Expert V8.0.6 分析软件进行回归分析以获得最优组合。

验证试验：根据响应面试验获得的最佳条件进行摇瓶发酵，比较真实值与预测值，确定优化结果。

1.2.4 分析方法 取1 mL 发酵液，加入乙醇4 mL，超声处理50 min，4 000 r/min 离心15 min，取上清进行HPLC 检测。

HPLC 条件： Zorbax SB-C18色谱柱 (250 mm ×4.6 mm, 5 μm)，流动相为V(甲醇) :V(乙腈) :V(水) =81 : 7 : 12，流速1 mL/min，检测波长240 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。采用外标法计算乙基伊维菌素的效价。

菌体浓度 (packed mycelial volume, PMV)：准确量取发酵液10 mL 于刻度离心管中，4 000 r/min离心15 min，检测固体所占发酵液的体积百分比即为菌体浓度。

总糖：采用斐林试剂法检测发酵过程中总糖含量[23]。

氨基氮：发酵过程发酵液中的氨基氮采用甲醛滴定法检测[24]。

数据分析：利用Design-Expert V8.06 软件对试验所获得的数据进行方差分析以确定数据显著差异性，进行响应面二次回归拟合并求解最优解。

2 结果与分析

2.1 菌种选育结果

2.1.1 物理诱变结果 对供试菌株孢子悬浮液进行UV 诱变后发现 (图1)，照射时间过长将导致菌株致死率高，而UV 照射时间短的菌种形态变化较大，得到的单菌落多为光秃型，突变株的发酵单位较出发菌株大幅降低，负突变率高，故而不采用UV 诱变作为选育的主要诱变手段。

图1 UV 诱变时间对S. avermitilis AVE-H39 菌株孢子致死率和正突变率的影响Fig.1 Effect of UV irradiation time on spore lethal rate and positive mutation rate of S. avermitilis AVE-H39 strain

由图2 可知：孢子悬浮液用ARTP 诱变处理30 s 时，致死率约为63%，正突变率约为2.2%；处理40 s 时致死率约为82%，正突变率约为4.8%，正突变率最高；处理50 s 时致死率约为90%，正突变率约为3.6%；处理60 s 时致死率约为97%，正突变率约为2.8%。因此选择40 s 作为ARTP 诱变处理时间。

图2 ARTP 诱变时间对S. avermitilis AVE-H39 菌株孢子致死率和正突变率的影响Fig.2 Effect of ARTP irradiation time on spore lethal rate and positive mutation rate of S. avermitilis AVE-H39 strain

2.1.2 化学诱变结果 由图3 可知：使用NTG 诱变时，正突变率较物理诱变有大幅提高，在NTG质量浓度为1 000 mg/L 时，正突变率最高，为13.8%，致死率约为79%；在NTG 质量浓度为500 mg/L 时，致死率约为53%，正突变率约为5.2%，致死率和正突变率相对都较低；在NTG 质量浓度为2 000 mg/L 时，致死率约为98%，正突变率却只有约为6.8%；在NTG 质量浓度为1 500 mg/L 时，致死率约为90%，正突变率约为12.6%，较为理想。因此选择1 000 和1 500 mg/L 的NTG处理40 min 作为主要的NTG 诱变条件。

图3 NTG 质量浓度对S. avermitilis AVE-H39 菌株孢子致死率和正突变率的影响Fig.3 Effect of NTG concentration on spore lethal rate and positive mutation rate of S. avermitilis AVE-H39 strain

由图4 可知：使用EMS 诱变时，菌株整体的致死率和突变率均不如NTG 诱变。在EMS 浓度为0.2 mol/L 时，致死率和正突变率都较低，致死率约为44%，正突变率约为3.6%；在EMS 浓度分别为0.4 和0.5 mol/L 时，致死率分别为76%和88%，正突变率分别为5.6%和5.7%；因此选择0.4 和0.5 mol/L 的 EMS 处理60 min 作为主要的EMS 诱变条件。

图4 EMS 浓度对S. avermitilis AVE-H39 菌株致死率和正突变率的影响Fig.4 Effect of EMS concentration on spore lethal rate and positive mutation rate of S. avermitilis AVE-H39 strain

本研究初始，甲基伊维菌素和乙基伊维菌素的发酵效价分别为1 936 和971 mg/L。选育前期采用物理诱变手段，以ARTP 诱变为主，当处理一段时间后菌株对物理诱变逐渐耐受、乙基伊维菌素发酵效价提升效率大幅降低时，改用化学诱变手段，以NTG 诱变和EMS 诱变交替使用，当菌株对单一化学诱变因素逐渐耐受后，再采用复合诱变手段。经过多轮选育之后获得了一株乙基伊维菌素的高产菌株 (图5)，经摇瓶发酵复筛，该菌株生产乙基伊维菌素的发酵效价最高可达4 125 mg/L，为原始菌株的4.25 倍，且甲基伊维菌素的摇瓶发酵效价降至791 mg/L (图6)，降幅为59%。从图5 中可以发现，与原始菌株相比，诱变获得的高产菌株在形态上已经发生了较大变化，且高产菌株产孢更少，褶皱更多。

图5 选育前后菌落形态对比Fig.5 Colony morphology before and after strain improvement

图6 选育前后摇瓶发酵HPLC 检测结果对比Fig.6 HPLC chromatograms of the shake-flask fermentation broths before and after strain improvement

2.2 发酵工艺优化结果

2.2.1 单因素试验 由图7 至图12 可知：最优速效碳源为甘露醇，最优迟效碳源为玉米淀粉；最优速效氮源为酵母抽提物，最优迟效氮源为黄豆粉；无机盐选择添加(NH4)2SO4效果最好，微量元素选择CoCl2、FeSO4。单因素试验进一步确定较优发酵条件：甘露醇30.0 g/L，玉米淀粉120.0 g/L，酵母抽提物20.0 g/L，黄豆粉30.0 g/L，CaCO33.0 g/L，(NH4)2SO43.0 g/L，CoCl20.01 mg/L，FeSO40.02 mg/L，转速220 r/min，pH 7.2，装液量30 mL/250 mL，接种量5%，温度28 ℃。

图7 速效碳源种类对发酵效价的影响Fig.7 Effect of available carbon sources on fermentation titer

图8 迟效碳源种类对发酵效价的影响Fig.8 Effect of delayed carbon sources on fermentation titer

图9 速效氮源种类对发酵效价的影响Fig.9 Effect of available nitrogen sources on fermentation titer

图10 迟效氮源种类对发酵效价的影响Fig.10 Effect of delayed nitrogen sources on fermentation titer

图11 无机盐种类对发酵效价的影响Fig.11 Effect of inorganic salts on fermentation titer

图12 微量元素种类对发酵效价的影响Fig.12 Effect of trace elements on fermentation titer

2.2.2 Plackett-Burman 试验 使用Design-Expert 8.0.6 软件进行Plackett-Burman 试验设计 (表1 和表2)，对试验结果进行方差分析 (表3)，其中，P＞ |t|值的大小决定了各个考察因素的显著水平，P≤ 0.05 证明该因素对乙基伊维菌素的发酵效价具有显著影响。结果发现：各因素中影响显著且从大到小的排序分别为A：玉米淀粉 (P= 0.009 6)、E：黄豆粉 (P= 0.028 3)、G：(NH4)2SO4(P= 0.036 2)，其他因素影响不显著(P＞ 0.05)。

表1 Plackett-Burman 试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels in Plackett-Burman experiment

表2 Plackett-Burman 试验结果Table 2 Results of Plackett-Burman experiment

表3 Plackett-Burman 试验结果的方差分析Table 3 ANOVA analysis of Plackett-Burman design

2.2.3 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman 试验结果，对玉米淀粉、黄豆粉和(NH4)2SO4这3 个关键因素设计并进行最陡爬坡试验。结果 (表4)表明： 在试验2 条件下，乙基伊维菌素的发酵效价最高，说明最优发酵条件在其附近，故以试验2的条件作为响应面试验因素的中心点。

表4 最陡爬坡试验结果Table 4 The corresponding responses of the steepest ascending experiment

2.2.4 响应面优化试验 根据最陡爬坡试验结果，使用Design-Expert V8.06 软件，采用Box-Benhnken 方法对选育得到高产菌株的发酵工艺进行三因子三水平响应面分析试验，试验因素水平及编码见表5，以A：玉米淀粉、B：黄豆粉、C：(NH4)2SO4为自变量，试验设计方案及结果见表6。

表5 Box-Behnken 试验因素水平及编码Table 5 Factors and levels in Box-Behnken experiment design

表6 Box-Benhnken 试验设计与结果Table 6 Design and results of Box-Benhnken experiment

对结果采用统计软件进行响应面二次回归拟合，得到二次多项回归方程：效 价Y= 4 856 + 151.00A+121.63B+ 20.38C+ 10.00AB- 24AC+ 2.75BC-162.13A2- 78.38B2- 139.37C2。对上述回归模型进行方差分析结果见表7。

由表7 可知：回归模型的P值为0.010 6 ＜0.05，失拟P值为0.243 3 ＞ 0.05，因此该模型显著且失拟不显著。该模型的决定系数和调整决定系数分别为R2= 0.946 9 和AdjR2= 0.853 1，说明该模型与样本的相关性较高，回归方程的拟合程度较好，其最终分析结果稳定可信，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。玉米淀粉与黄豆粉、玉米淀粉与(NH4)2SO4、黄豆粉与(NH4)2SO4相互影响的等高线及响应面见图13、14 和15。对该模型求极大值，当玉米淀粉为149.8 g/L、黄豆粉为38.1 g/L、(NH4)2SO4为3.04 g/L时，乙基伊维菌素的发酵效价达到理论预测的最大值4 942.34 mg/L。对其他因素和条件结合单因素试验结果进行选择，优化后培养基组成及发酵条件为：玉米淀粉149.8 g/L，黄豆粉38.1 g/L，(NH4)2SO43.04 g/L，甘露醇30.0 g/L，酵母抽提物20.0 g/L，CaCO33.0 g/L，CoCl20.01 mg/L，FeSO40.002 mg/L，转速220 r/min，pH 7.2，装液量30 mL/250 mL，接种量 5%，发酵温度28 ℃。

图13 玉米淀粉与黄豆粉对乙基伊维菌素效价的交互影响Fig.13 Interaction effect of corn starch and soybean powder on the titer of ethyl ivermectin

表7 回归模型的方差分析Table 7 ANOVA analysis for response surface quadratic model

图14 玉米淀粉与(NH4)2SO4 对乙基伊维菌素效价的交互影响Fig.14 Interaction effect of corn starch and (NH4)2SO4 on the titer of ethyl ivermectin

2.2.5 验证试验 采用调整优化后的培养基及发酵条件进行验证试验，乙基伊维菌素的发酵效价达到4 965 mg/L，较优化前的工艺提高了20%，与理论值4 942.34 mg/L 的偏差为0.46%，实测值与模拟预测值接近，表明该模型合理可靠，具有实用价值。另外，验证试验实测甲基伊维菌素的发酵效价为784 mg/L，没有增长，说明该培养基组成有利于菌株乙基伊维菌素单组分的累积。

2.2.6 罐发酵试验 根据响应面优化的结果，在50 L 发酵罐中进行工艺放大，发酵过程中的菌体浓度 (PMV)、总糖、氨基氮、pH 及乙基伊维菌素的发酵效价等代谢相关参数变化曲线见图16。由图可知，发酵液中总糖在整个发酵过程中一直呈下降趋势，前96 h 下降较快，之后缓慢下降，在接近发酵终点时基本保持不变；氨基氮在前48 h内急速下降，之后一直上下波动；PMV 在48 h 达到高峰，其前期的变化基本与总糖和氨基氮的消耗成正比，之后较长一段时间内稳定在50% 左右，发酵后期PMV 下降，原因可能在于菌丝老化自融；发酵液pH 值总体呈现先下降后上升的趋势，前14 h 内pH 值下降较快，之后开始缓慢上升，发酵264 h 之后pH 值开始快速上升，接近发酵终点时pH 值趋近8.0。发酵产物乙基伊维菌素在发酵24 h 就可以检测到，整个发酵周期呈上升趋势，前200 h 左右效价日增量较多，之后产物累积速率放缓，接近发酵终点时略有下降，发酵288 h 时乙基伊维菌素的效价达到峰值，为4 886 mg/L，略低于摇瓶发酵。

图15 黄豆粉与(NH4)2SO4 对乙基伊维菌素效价的交互影响Fig.15 Interaction effect of soybean powder and (NH4)2SO4 on the titer of ethyl ivermectin

图16 发酵代谢相关参数变化曲线Fig.16 Variation curves of metabolism-relevant parameters during the fermentation process

3 结论与讨论

通过合成生物学手段获得的甲基和乙基伊维菌素作为新一代十六元大环内酯类杀虫抗生素，关于其发酵效价的研究报道比较少，除本研究的原始菌株外，Huang 等报道的基因工程菌株中甲基和乙基伊维菌素总效价为3 400 mg/L，HPLC 图谱显示其中乙基伊维菌素的含量不足1/3[14]，目前国内外尚无对其产生菌诱变选育的研究报道。与阿维菌素在120～550 m3发酵罐中9 000 mg/L 以上的发酵效价相比[25]，乙基伊维菌素的发酵单位较低，制约了其产业化开发。因此，通过选育手段，得到乙基伊维菌素的高产菌株，可以推动其产业发展。在链霉菌菌种选育中，单一诱变手段使用一段时间后会出现钝化现象，引起微生物的回复突变，导致菌种选育效率大幅降低[26-28]。本研究在对多个单一诱变法进行考察的基础上，采用多种诱变手段对基因工程菌S.avermitilisAVE-H39进行了多轮选育，获得了乙基伊维菌素的高产突变菌株，其发酵效价水平达到4 125 mg/L，较出发菌株的发酵效价提高了4.25 倍，菌株的外观形态相比原始菌株也发生了较大变化。

响应面优化法是通过将复杂的组合因素在小区域内用多项式模型来拟合、计算，具有试验次数少、精度高等优点，被广泛应用于发酵工艺优化[29-32]。本研究通过响应面法优化了乙基伊维菌素高产菌株的发酵工艺。在优化培养基的方案中，考虑到微生物生长代谢，设计了速效碳源和迟效碳源搭配，速效氮源和迟效氮源搭配，添加无机盐和微量元素，较为全面地满足了菌株全产程的营养需求。通过单因素试验确定最优速效碳源为甘露醇，最优迟效碳源为玉米淀粉；最优速效氮源为酵母抽提物，最优迟效氮源为黄豆粉；无机盐选择(NH4)2SO4；微量元素选择CoCl2和FeSO4。通过Plackett-Burman 试验筛选确定了关键因子为玉米淀粉、黄豆粉和(NH4)2SO4，通过最陡爬坡试验确定了关键因子的最适浓度范围，采用响应面法优化发酵工艺，确定了其最佳发酵条件为：玉米淀粉149.8 g/L，黄豆粉38.1 g/L，(NH4)2SO42.04 g/L，甘露醇30.0 g/L，酵母抽提物20.0 g/L，CaCO33.0 g/L，CoCl20.01 mg/L，FeSO40.002 mg/L，转速220 r/min，pH 7.2，装液量30 mL/250 mL，接种量5%，发酵温度28 ℃。经验证，在优化后的条件下，高产乙基伊维菌素的突变菌株，其摇瓶发酵效价可达到4 965 mg/L，与模拟预测值接近。根据响应面优化的结果，50 L 罐放大发酵时乙基伊维菌素效价峰值达4 886 mg/L，并统计了50 L 罐发酵过程中的菌体浓度、总糖、氨基氮、pH 值等代谢相关参数变化，为乙基伊维菌素大规模发酵生产提供了参考。

本研究通过菌种选育和发酵工艺优化，极大地提高了乙基伊维菌素的发酵效价水平，使得开发和生产以乙基伊维菌素为主成分的新农药品种具有了经济可行性，后续还可以通过高产关键元件的精确定位、改造及制备工艺的优化，进一步降低其生产成本，提升经济价值。