茶叶茶氨酸与酸枣仁水提物的改善睡眠作用的研究

2022-12-27朱晶晶

现代食品 2022年21期

◎ 朱晶晶，焦劼

（上海诺德生物实业有限公司，上海 200030）

失眠是目前社会上普遍的睡眠障碍，其中，我国有1/3 以上的成年人存在睡眠障碍[1]。L-茶氨酸（N-乙基L-谷氨酰胺）是由日本科学家酒户弥二郎于1950年第一次从玉露茶中分离提取[2]，是一种具有呈鲜味作用的非蛋白氨基酸。国家卫生和计划生育委员会发布《关于批准茶叶茶氨酸为新食品原料等的公告（2014年第15号）》，正式批准茶叶茶氨酸为新食品原料。已有研究表明，L-茶氨酸具有改善睡眠的作用[3-7]。茶氨酸改善睡眠的作用机理可能与抑制神经性兴奋、促进脑电波α 波释放，以及与戊巴比妥类催眠药物有协同作用相关[8]。

酸枣仁（又被称为“东方睡果”）为传统的药食同源类物质，具有养心补肝、宁心安神的功效，多用于缓解虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴[9]。临床研究结果表明，酸枣仁有宁静安神、助眠等功效[10-12]。现代药理学研究结果也表明，酸枣仁具有镇静催眠[13-15]、保护心血管[16-18]、降血压和降血脂[19-21]等作用。

模式生物斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一。它具有两个鲜明的特点和优势。①斑马鱼的胚胎是透明的。科学家们很容易能够观察到药物或功能性物料对其体内器官的影响。②斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%。这表明，药物或功能物料在斑马鱼上获得的实验结果在多数情况下也适用于人体。同时，与传统的免疫学模式生物——小鼠相比，模式生物斑马鱼还具有体型小、子代数量多、培育要求低、易于养殖及饲养成本低等优势。因此，利用模式生物斑马鱼进行药物或功能物料的生理学功能的验证和评价，越来越受到欢迎。

目前，关于L-茶氨酸和酸枣仁对改善睡眠的研究很多，但将酸枣仁水提物与天然来源的茶叶茶氨酸联合使用的研究较少。据此，本研究基于戊四唑诱导建立的斑马鱼失眠模型，以奥沙西泮对阳性对照药物，分别研究了茶叶茶氨酸和酸枣仁水提物的改善睡眠的作用，同时，也进一步将茶叶茶氨酸和酸枣仁水提物联用，研究了酸枣仁茶叶茶氨酸复合物的改善睡眠的作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

茶叶茶氨酸（批号：19111503，上海诺德生物实业有限公司）；酸枣仁水提物（批号：191218，上海诺德生物实业有限公司）；酸枣仁茶叶茶氨酸复合物（批号：191219，茶叶茶氨酸﹕酸枣仁水提物=1﹕1，上海诺德生物实业有限公司）；戊四唑[PTZ，批号：404-520-2，阿拉丁试剂（上海）有限公司]；奥沙西泮（批号：20180703，北京益民药业有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，批号：D9912280，Sigma-Aldrich）。

1.2 实验动物

选用正常野生型AB 品系斑马鱼，年龄为5 dpf，共870 尾。斑马鱼饲养条件：养鱼用水的温度为28 ℃，速溶海盐的添加量为200 mg·L-1（模拟斑马鱼生活的水环境，并补充斑马鱼正常生活所需的钠、钙和镁等多种矿物质营养元素），其电导率为480～510 μS·cm-1；硬度为53.7～71.6 mg·L-1CaCO3，pH 为6.9～7.2。

1.3 仪器与设备

解剖显微镜（SZX7，奥林巴斯公司，日本）；与显微镜相连的相机（VertA1）；运动/行为分析记录仪（V3.11，ViewPoint 生命科学公司，法国）；精密电子天平（CP214，奥豪斯公司，美国）；6 孔板和96 孔板（赛默飞世尔公司，中国）。

1.4 实验方法

1.4.1 溶液配制

（1）戊四唑（690.85 μg·mL-1）的配制。精密称取0.691 g戊四唑于烧杯中，养鱼用水溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成6.91 mg·mL-1的戊四唑溶液。使用时，用养鱼用水稀释成690.85 μg·mL-1。

（2）奥沙西泮（40 μg·mL-1）的配制。精密称取4.000 g 奥沙西泮于烧杯中，用30 mL 二甲亚砜（DMSO）溶液溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配制成40 mg·mL-1的奥沙西泮溶液。使用时，用二甲亚砜溶液稀释成40 μg·mL-1。

（3）酸枣仁水提物浓度梯度配制。精密称取0.100 g的酸枣仁水提取物，用30 mL 蒸馏水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配制成1 mg·mL-1的酸枣仁水提物溶液。使用时，分别用蒸馏水稀释成62.5 µg·mL-1、125.0 µg·mL-1、250.0 µg·mL-1和500.0 µg·mL-1。

（4）茶叶茶氨酸浓度梯度配制。精密称取0.200 g的茶叶茶氨酸，用30 mL 蒸馏水溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成2 mg·mL-1的茶叶茶氨酸溶液。使用时，分别用蒸馏水稀释成125 µg·mL-1、250 µg·mL-1、500 µg·mL-1和1 000 µg·mL-1。

（5）酸枣仁茶叶茶氨酸复合物浓度梯度配制。精密称取0.200 g的酸枣仁茶叶茶氨酸复合物，用30 mL蒸馏水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配制成2 mg·mL-1的酸枣仁茶叶茶氨酸溶液。使用时，分别用蒸馏水稀释成125 µg·mL-1、250 µg·mL-1、500 µg·mL-1和1 000 µg·mL-1。

1.4.2 实验设置

（1）对照组。①正常对照组。选取30 尾正常斑马鱼，给予3 mL 养鱼用水。②模型对照组。选取30 尾正常斑马鱼，给予3 mL 养鱼用水。处理斑马鱼24 h 后，使用690.85 μg·mL-1戊四唑诱导1 h 建立斑马鱼失眠模型。③阳性对照组。选取30 尾正常斑马鱼，给予3 mL 的40 μg·mL-1的奥沙西泮溶液。

（2）实验组。①斑马鱼最大耐受浓度测定实验组。将450 尾斑马鱼置于6 孔板中，每孔30 尾。酸枣仁水提物实验组分别水溶给予3 mL 的62.5 µg·mL-1、125.0 µg·mL-1、250.0 µg·mL-1、500.0 µg·mL-1和1 000.0 µg·mL-1浓度酸枣仁水提物；茶叶茶氨酸实验组分别水溶给予3 mL 的125 µg·mL-1、250 µg·mL-1、500 µg·mL-1、1 000 µg·mL-1和2 000 µg·mL-1浓度的茶叶茶氨酸；酸枣仁茶叶茶氨酸复合物实验组分别水溶给予3 mL 的125 µg·mL-1、250 µg·mL-1、500 µg·mL-1、1 000 µg·mL-1和2 000 µg·mL-1浓度的酸枣仁茶叶茶氨酸复合物。②改善睡眠作用评价实验组。选取270 尾斑马鱼于6 孔板中，每孔30 尾。酸枣仁水提物实验组分别水溶给予3 mL 的62.5 µg·mL-1、125.0 µg·mL-1和250.0 µg·mL-1浓度的酸枣仁水提物；茶叶茶氨酸实验组分别水溶给予3 mL 的62.5 µg·mL-1、125.0 µg·mL-1和250.0 µg·mL-1浓度的茶叶茶氨酸；酸枣仁茶叶茶氨酸复合物实验组分别水溶给予3 mL 的125 µg·mL-1、250 µg·mL-1和500 µg·mL-1浓度的酸枣仁茶叶茶氨酸复合物。

1.4.3 茶叶茶氨酸、酸枣仁水提物和酸枣仁茶叶茶氨酸复合物最大耐受浓度（MTC）测定

各实验组、正常对照组和模型对照组处理24 h后和PTZ 共同处理1 h，观察并记录，实验斑马鱼的毒性表型和死亡情况，确定茶叶茶氨酸、酸枣仁水提物和酸枣仁茶叶茶氨酸复合物对失眠模型斑马鱼的MTC。

1.4.4 基于总运动距离的茶叶茶氨酸、酸枣仁水提物和酸枣仁茶叶茶氨酸复合物改善睡眠作用的评价

各组处理24 h 后，将斑马鱼转移至96 孔板中，每孔1 尾。除正常对照组外，其余实验组用690.85 μg·mL-1的PTZ 诱导斑马鱼1 h 建立失眠模型。每组随机选择10 尾斑马鱼，采用行为分析仪测定的方法，测定实验斑马鱼的总运动距离，以总运动距离评价茶叶茶氨酸、酸枣仁水提物和酸枣仁茶叶茶氨酸复合物对失眠斑马鱼的睡眠改善作用。

1.4.5 数据分析

茶叶茶氨酸、酸枣仁水提物和酸枣仁茶叶茶氨酸复合物对失眠症斑马鱼的睡眠改善作用，其计算公式为

采用Graph 软件对数据进行分析，统计学分析采用方差分析和Dunnett's T-检验，p＜0.05 表明具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 茶叶茶氨酸、酸枣仁水提物和酸枣仁茶叶茶氨酸复合物的最大耐受浓度（MTC）

由表1可知，在62.5～250.0 μg·mL-1酸枣仁水提物对斑马鱼未产生任何明显的毒副作用，也未引起斑马鱼死亡；500.0 µg·mL-1浓度组诱发10%（3/30 尾）斑马鱼死亡；1 000.0 µg·mL-1浓度组诱发100%（30/30尾）斑马鱼死亡。因此，在该模型下，酸枣仁水提物的最大使用浓度为250.0 μg·mL-1（表1）。最终，选择62.5 µg·mL-1、125.0 µg·mL-1和250.0 µg·mL-1的酸枣仁水提物用于后续实验。

在125.0～1 000.0 μg·mL-1茶叶茶氨酸对斑马鱼未产生任何明显的毒副作用，也未引起斑马鱼死亡；2 000 µg·mL-1浓度组诱发3.33%（1/30 尾）斑马鱼死亡和8 尾脊椎弯曲。因此，在该模型下，茶叶茶氨酸的最大使用浓度为1 000 μg·mL-1。为了保证后续的功能验证实验中茶叶茶氨酸样品浓度和酸枣仁样品浓度一致，最终选择62.5 µg·mL-1、125.0 µg·mL-1和250.0 µg·mL-1的茶叶茶氨酸用于后续实验。

在125～500 μg·mL-1酸枣仁茶叶茶氨酸复合物对斑马鱼未产生任何明显的毒副作用，也未引起斑马鱼死亡；1 000 µg·mL-1浓度组诱发30%（9/30 尾）斑马鱼死亡；2 000 µg·mL-1浓度组诱发100%（30/30 尾）斑马鱼死亡。因此，在该模型下，酸枣仁茶叶茶氨酸复合物的最大使用浓度为500 μg·mL-1（表1）。最终，选择125 µg·mL-1、250 µg·mL-1和500 µg·mL-1的酸枣仁茶叶茶氨酸复合物用于后续实验。

表1 茶叶茶氨酸、酸枣仁水提物和酸枣仁茶叶茶氨酸复合物处理后“浓度-致死性-毒性表型”结果表（n=30）

2.2 基于总运动距离的茶叶茶氨酸、酸枣仁水提物和酸枣仁茶叶茶氨酸复合物改善睡眠作用的评价

茶叶茶氨酸、酸枣仁水提物和酸枣仁茶叶茶氨酸复合物对斑马鱼改善睡眠作用定量数据如表2所示。模型对照组中，斑马鱼运动距离（9 236 mm）远高于正常对照组（5 094 mm，p＜0.001），这表明模型建立成功；阳性对照组的运动距离为7 287 mm，低于模型对照组（p＜0.001），睡眠改善作用为47%。这表明，奥沙西泮对失眠斑马鱼的睡眠质量具有明显的改善作用。

62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1和250.0 μg·mL-1的酸枣仁水提物处理组的斑马鱼的运动距离分别为7 598 mm（p＜0.01）、5 539 mm（p＜0.001）和4 701 mm（p＜0.001），均低于模型对照组，睡眠改善作用分别达到40%、89%和109%。这表明，在125 μg·mL-1和250 μg·mL-1的实验浓度下，酸枣仁水提物对失眠斑马鱼的睡眠质量具有明显的改善作用。

62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1和 250.0 μg·mL-1的茶叶茶氨酸处理组的斑马鱼的运动距离分别为7 986 mm（p>0.05）、6 646 mm（p＜0.001）和8 017 mm（p>0.05），均低于模型对照组，睡眠改善作用分别达到30%、63% 和29%（表2）。这表明，在125 μg·mL-1浓度条件下，茶叶茶氨酸对PTZ 诱导的失眠斑马鱼具有明显的睡眠改善作用；62.5 μg·mL-1和250 μg·mL-1实验浓度条件下，茶叶茶氨酸对失眠斑马鱼具有一定的睡眠改善作用。

125 μg·mL-1、250 μg·mL-1和500 μg·mL-1的酸枣仁茶叶茶氨酸复合物处理组的斑马鱼的运动距离分别为7 952 mm（p＜0.01）、5 920 mm（p＜0.001）和4 544 mm（p＜0.001），均低于模型对照组，睡眠改善作用分别达到31%、80%和113%（表2）。这表明，在250 μg·mL-1和500 μg·mL-1的浓度下，酸枣仁茶叶茶氨酸复合物对PTZ 诱导的失眠斑马鱼具有明显的睡眠改善作用。