光遗传学在中枢神经系统疾病治疗中的应用

班德翔 向振洋 刘 洋 曹富江*

（天津医科大学总医院骨科，天津 300052）

光遗传学（optogenetics）这一概念于2006年首次被提出[1]，以其毫秒级精准的时间和空间精度的优势广泛地运用于神经科学的各个领域，从探索单个突触的属性到研究神经回路内和跨神经回路的特定神经细胞群体，再到操作复杂的行为。Thompson和Towne[2]于2016年将光遗传学定义为一种使用光控制活体组织中细胞的方法，表达光敏蛋白的神经元细胞尤为典型。光遗传学技术为精确控制细胞功能提供了可能性，相关技术使对蛋白质功能调控、信号通路激活及动物行为的时空精确控制成为可能，为研究神经回路及信号网络提供了独特的方法。近几年，光遗传学技术在中枢神经系统疾病病理生理机制及相关的治疗上的研究尤为突出。中枢神经系统疾病传统的治疗方案，如药物治疗、脑深部刺激（DBS）和手术治疗中，存在药物作用缓慢，不良反应多；脑深部刺激（DBS）有创，缺乏细胞类型特异性，需要永久植入电极[3]；手术治疗无法精准地定位特定病变脑区等一系列缺点。而光遗传学因其具有非侵入性，可以精确地定位，具有精准的时间和空间精度，可以在多个波长和位置同时使用，以及具有显示特定神经元及神经元群体存活和特定分子的活性的优势，因而越来越多的运用于中枢神经系统疾病的机制和相关治疗的研究中。因此，本篇综述主要集中在介绍光遗传学技术的基本原理和最近几年技术最新的进展，及其在中枢神经系统疾病（如难治性癫痫、帕金森等）的机制研究和治疗方面的应用进展。

1 光遗传学技术

光遗传学技术是一项光学和遗传学相结合的开拓性技术，广泛运用于对特定神经元及神经回路的研究。通常涉及3个核心特征：①视蛋白，可对光做出反应，直接引起跨细胞膜的电流。②将足够强和特异的视蛋白基因表达定向到大脑中定义明确的细胞元件的一般方法。③在试验对象进行感兴趣的行为时，将足够强的和精确定时的光刺激送达到特定大脑区域或细胞的一般方法[4]。

1.1 视蛋白及变体 视蛋白由视网膜和一种七次跨膜的光敏蛋白组成。视蛋白根据其功能可以分为两大类：一类是通道视紫红质（ChR2），其对蓝光敏感。在蓝光的刺激下，非特异性阳离子通道被打开，各种阳离子（Na+、K+等）进入细胞，导致细胞去极化[5]。另外一类是细菌视紫红质和卤视紫红质（NpHR）。细菌视紫红质在受到刺激时将H+运送到细胞外，并且卤代视紫红质也可以在黄光的刺激下将Cl-向细胞内转移[6]。它们都可以在不同波长光的刺激下，开放不同的离子泵使细胞超极化，抑制细胞的活动。可以根据试验目的（激活或者抑制细胞）选用合适的视蛋白。基于光谱的不同，天然视蛋白及其变体也越来越多地被发现。随着这几年光遗传学实验的井喷式增加，天然微生物视蛋白及变体的缺陷也显现出来。由于不同波长的光在组织中的穿透和散射方式不同，只有高强度的光才能满足光遗传刺激的要求，这也会导致热量积累和潜在神经元的损伤。所以在过去几年，一个新的微生物视蛋白家族已经通过基因工程改造迅速发展，以弥补这些限制。如红光在组织中的被吸收与散射较少，可以将ChR2（光遗传学中应用最广泛的视蛋白）的波长刺激峰由蓝色改为红色，以便刺激组织更深区域。光遗传学技术的需求刺激了视蛋白变体工程改造的发展，也反过来引领光遗传技术不断向前。

1.2 视蛋白表达 视蛋白基因转导是视蛋白表达的基础。视蛋白的表达需要在细胞基因组中表达基因转导的视蛋白基因。转导方式有3种：病毒载体、转基因、电穿孔[7]。本研究将重点放在使用病毒载体进行神经元转导，此方法是目前在临床研究中使用最广泛且最有效的视蛋白转导方式。

将病毒载体注入特定的大脑位置以实现光遗传刺激，通常包括慢病毒（LV）或腺相关病毒（AAV）。这两种病毒具有不同的特性，在临床应用中也有相应优缺点。与直径约为20 nm的AAVs不同，LV更大的颗粒尺寸（100 nm）局限了其可通过胞外空间扩散。相反AAVs颗粒较小，允许进一步扩散，使其能够在给定的体积内进行转导[8]。对于AAV9和AAVrh10，另一个优点是它们可以穿过血脑屏障，因此当病毒载体在外周给药时，大脑神经元可以被转导。但LV载体具有更大的基因组容量，其最大包装效率的基因组容量为8～10 kb[9]，这具有重要的特异性和功能意义，因为可以插入更长的基因序列和多个基因。在另一方面，AAV在一定程度上优于慢病毒，这是因为基于AAV的载体保持在表型，而慢病毒载体整合到宿主基因组中[10]。所以，慢病毒载体的表达容易受到周围染色质的影响，这种整合可能会导致宿主基因的意外中断。总之，AAVs是人类基因治疗及非人灵长类光遗传学技术中视蛋白基因转导最常用的载体。

1.3 光刺激 在将合适波长且足够强的和精确定时的光刺激特定大脑区域或神经元的过程中，光的传输也是相当重要且复杂的。一般来说，使用最广泛的光源是激光或发光二极管，它们需要复杂的电阻和功率传输元件，并且通常太大或太重。经典的光传输设备包括外部光源、控制器设备、光纤和探头[11]。因为视蛋白激活所需的可见光能够被神经组织散射和吸收，所以光遗传神经调节依赖于植入的装置来传递光学刺激。

在光遗传学体内试验中，利用光纤将特定波长的激光，以不同的脉冲持续时间、辐照度和频率精准地导入到特定脑区激活或抑制脑区的神经元，从而进一步研究特定脑区对动物相关行为的调控机制。

同时可见光的传递通常需要将外来装置侵入性地植入大脑，这不仅损害了相关组织，还增加了感染和缺血的风险[12]。为了克服这些限制，在一些成熟的神经记录技术（如Utah列阵，Michigan探针，四极管和微丝等）的基础上，通过探索软材料和混合材料，设计出多种多功能和柔性光电探测器。如柔性纤维探针，并且能够在小鼠大脑和脊髓中同时记录和进行光学神经调节，而不会引发显著炎性反应[13]。

2 光遗传学在中枢神经系统疾病治疗中的运用

2.1 在癫痫病中的应用 癫痫是一种异质性疾病，由于脑神经元的过度兴奋和过度同步，癫痫的特征是反复自发性癫痫发作。这种异常自发放电可对形体活动、认知以及意识产生影响，并导致临床出现痫性发作。癫痫的特征是大脑中异常的神经活动，最终导致症状的反复发作。传统的治疗方案有药物、手术切除和电刺激。尽管大多数患者能够使用抗癫痫药控制癫痫发作，但是患者通常需要终身用药，这同时也与患者耐受性差的不良反应相关，尤其是需要多种药物治疗的患者[14]。传统的抗癫痫药物药理机制，由于不具有良好的细胞特异性，无法对癫痫神经回路上的特定神经细胞群体发挥针对性作用，因此通常很难通过药理学方法有效治疗。而且对人类癫痫发作的潜在机制不完全了解，更好的治疗方法的发现一直滞后。所以急需开发能够从源头上治疗癫痫病的技术。通常难治性癫痫是局灶性的，最有效的治疗方案是切除手术，但其仅适用于少数患者，因为手术切除会带来神经系统缺陷的风险，如记忆力、语言、运动和视觉障碍等，特别是切除区域位于大脑活动区。另外，与药物治疗或外科手术切除相比，电刺激能对脑部进行更具针对性和可逆性的治疗，但仅对病理回路进行有效靶向治疗仍然是一个挑战，治疗可能会导致不良的不良反应，如记忆障碍，抑郁加剧或癫痫发作加剧等[15]。因为电刺激对周围组织的影响不是细胞类型特异性的，并且高度依赖于患者特定的神经解剖结构，这可能很难预测。考虑到潜在的不良反应，更加急需癫痫患者的临床新疗法。

光遗传学是一种利用光敏离子通道来激活或者抑制特定神经元活动的技术，可以选择性地调节抑制性或兴奋性神经元的行为来改变特定神经元的行为，以防止癫痫发作而不会破坏生理功能。光遗传刺激激活海马兴奋性细胞中表达的NpHR，将NpHR的表达限制在兴奋性神经元中，抑制了癫痫的发作[16]。这些结果在连续运动性癫痫发作活动的体内模型（模拟人类局部癫痫持续状态）中得以再现。连续运动性癫痫发作在对全身性药物治疗特别有抵抗力，但是在癫痫局灶处激活NpHR抑制了癫痫的发作[17]。这些研究提供了光遗传学作为治疗癫痫的潜力。光遗传学不仅为我们提供了一种新的治疗方法，还为了解癫痫发作的机制和调节癫痫发作活动的网络提供新的思路。在皮质卒中模型中，用NpHR抑制丘脑皮质神经元可阻止皮质中的尖峰波放电；在边缘性癫痫模型中，用NpHR抑制兴奋性神经元或用ChR2激活中间神经元，抑制海马癫痫发作[18]。还可以通过光遗传学刺激相对较远的结构（如小脑）来调节边缘性癫痫发作。光遗传学提供了一种更精确的方式来调节大脑区域内神经元。

近年来，研究报道星形胶质细胞参与了癫痫的发病机制[19]。星形胶质细胞在癫痫发生中的生理病理作用，涉及反应性星形胶质细胞增生、能量供应和代谢紊乱、神经胶质递质和细胞外离子浓度，以及血脑屏障功能障碍和血流失调。受损的星形胶质细胞功能和能量稳态在癫痫的发病机制中起着关键作用。只有当神经元有足够的能量来源时，才会发生过度的神经元放电。相反，癫痫发作期间的能量消耗是癫痫发作终止的内源性机制。星形胶质细胞通过神经代谢耦合控制神经元能量稳态[20]。利用光遗传学技术特异性调控皮质星形胶质细胞，探索其在癫痫发病中的作用并发挥治疗作用。星形胶质细胞在癫痫发病机制中的谷氨酸稳态与能量代谢方面发挥着重要作用。有研究报道，光刺激会触发表达ChR2的星形胶质细胞释放ATP[21-22]。以及可以通过开放非选择性阳离子通道进一步通过Ca2+依赖性和非依赖性机制释放谷氨酸。因此，星形胶质细胞通过神经代谢耦合控制神经元能量稳态可能是一种有效的抗癫痫策略。同时，光遗传学最令人兴奋的方面是能够使用闭环系统，其中植入的EEG设备检测到癫痫发作的开始，从而触发发光设备，激活特定类别中表达的视蛋白神经元。闭环光遗传学方法已经成功地用于通过抑制丘脑皮质神经元来停止皮质中的癫痫发作活动，并通过抑制局部锥体细胞，激发局部含小白蛋白的中间神经元或激活远程小脑浦肯野细胞抑制癫痫发作[23]。

2.2 在帕金森病中的应用 帕金森（parkinson's disease，PD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是肌肉僵硬、运动缓慢和震颤。其发病机制是黑质致密部（SNc）中多巴胺能（DA）神经元的丧失，导致基底节（BG）中的神经元活动异常。主要是因为患者的神经系统活动发生变性，且随着时间的推移，患者的症状会更加严重。此病一般多出现在老年人中，但近几年越来越趋于年轻化[24]。

目前PD的治疗方案主要包括左旋多巴（L-DOPA），多巴胺激动剂或MAO-B抑制剂的给药或深部脑刺激（DBS）形式的手术或神经消融手术。但是这些治疗是对症治疗，不能预防PD恶化，并且可能伴有明显的不良反应，而且深部脑刺激（DBS）缺乏空间特异性，不能精确地定位到靶细胞中。因此，显然有必要探索新的治疗途径[25]。光遗传学的出现，能让我们从神经元及神经回路的水平上更深一步地了解帕金森病的发病机制以及对其诊断和治疗方面有新的认识。最近的一些研究显示，光遗传学刺激可以改善帕金森氏啮齿动物的运动行为。研究表明，对丘脑下核（STN）或新皮质M1区域的第5层进行高频光遗传学刺激可改善经6-羟基多巴胺（6-OHDA）处理的小鼠的运动行为[26]。这表明光遗传学刺激可以用作电DBS的更具选择性的替代方法，从而刺激选择性的STN群体，而不是电DBS的非特异性作用。有研究发现使用光遗传学刺激NpHR可以对STN中的谷氨酸能细胞进行光遗传学低频抑制，既可以减少帕金森氏症的行为，又可以减少6-OHDA处理的大鼠的L-DOPA诱导的运动障碍。研究报道[27]，在双侧6-OHDA损伤的D1-Cre和D2-CreBAC转基因小鼠纹状体中表达ChR2。通过光遗传刺激直接和间接通路的中间棘状投射神经元（MSN），观察到直接通路激活后运动行为完全恢复到病变前的水平。光遗传技术为帕金森的发病机制的研究及治疗提供了可行的策略。

2.3 在阿尔兹海默病及术后认知功能障碍中的应用 阿尔茨海默病（alzheimer's disease，AD）是一种渐进的多因素神经退行性疾病。临床上AD的病理特点是记忆、认知和运动功能严重缺陷，导致精神、行为和功能活动的下降，如失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变，病因迄今未明。目前临床上使用抗AD药物仍主要是胆碱酯酶抑制剂（如多奈哌齐、加兰他敏、卡巴拉汀和石杉碱甲等）和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂（如美金刚），但是这些药物疗效有限且不良反应明显，如胃肠道反应和神经系统反应等。光遗传技术的优势在于可以控制特定神经回路的活动。研究表明，光刺激双侧海马齿状回中表达CaMK-CHR2的神经元改善了测试阶段的工作记忆和短期记忆[28]。最近研究报道了AD小鼠空间学习记忆缺陷的突触机制[29]，内嗅皮质Ⅱ（ECII PN）锥体神经元的突触末端直接支配CA1小清蛋白（PV）神经元（CA1 PV）并在早期AD小鼠中选择性退化，ECII PN-CA1 PV突触的缺失会破坏CA1回路中的兴奋性和抑制性平衡，并损害空间学习和记忆。ECIIPN的光遗传学激活通过θ脉冲刺激范式能诱导有益效果并有效防止AD小鼠的突触和行为衰退。通过光遗传技术为治疗AD疾病进展提供了一个有希望的靶点。

2.4 在抑郁症中的应用 抑郁症又称抑郁障碍，抑郁是一种情绪障碍，其特征是情绪低落或失去兴趣或愉悦，其他症状包括体质量、食欲和睡眠情况的波动；无价值感；优柔寡断或难以集中注意力；自杀意念。重度抑郁症严重限制心理社会功能，降低生活质量。目前，抑郁的治疗方法包括药物疗法、心理疗法和几种所谓的躯体干预方法，如电休克疗法[30]、光疗法[31]、迷走神经刺激[32]和经颅磁刺激[33]。

光遗传学出现彻底改变了抑郁的神经回路机制的研究。光遗传学已经阐述了抑郁的特定细胞类型和投射途径，推动对抑郁的基于神经回路研究的转变。光遗传学工具成为了研究动物模型中抑郁样行为背后的神经回路的关键，借助光遗传学阐明了腹侧被盖区、伏隔核、内侧前额叶皮质、腹侧海马和其他边缘区域对压力易感性发挥了关键作用[34]。使用光遗传学技术，已经发现压力环境和腹侧海马-伏隔核回路的阶段性激活是诱导社交回避的必要条件。研究表明[35]，在慢性社交失败压力的抑郁症小鼠模型中，使用光遗传学操作双向控制传入特定的突触功能，证明了腹侧海马中谷氨酸能信号传导在抑郁相关行为中的复杂传入特异性作用。慢性压力可能会将平衡从内侧前额叶皮质转移到腹侧海马控制，从而形成一个强化循环，进一步增强腹侧海马-伏隔核的突触传递。最近研究报道[36]，对腹侧被盖区-伏隔核回路的选择性光遗传学激活增加了D1-多棘神经元中Shisa6的表达。Shisa6特异性位于D1-多棘神经元的兴奋性突触中并增加神经元的兴奋性，从而促进小鼠的抑郁样行为。同样，也可以通过使用光遗传学技术改变特定细胞类型中的神经元活动来改变抑郁样行为。有研究报道[37]，内侧前额叶皮质神经元的光遗传激活逆转了动物失败社交和蔗糖偏好，这表明诱导内侧前额叶皮质神经元的过度活跃可能足以抑制一些与抑郁症相关的行为。综上可见，光遗传学在治疗抑郁症方面具有广阔前景。

2.5 在亨廷顿舞蹈症中的应用 亨廷顿舞蹈症（huntington' disease，HD）是一种罕见的常染色体显性遗传性神经退行性疾病，症状复杂多变，以慢性进行性舞蹈样动作、认知功能障碍和精神行为异常为主要临床特征，是由亨廷顿基因（HTT）中的CAG三核苷酸重复扩增引起的，该基因编码亨廷顿蛋白（HTT）中扩增的聚谷氨酰胺[38]。细胞和分子研究表明，脑发育异常可能是HD脑功能受损和后来神经变性的底物。先前研究表明，突变的HTT（MHTT）相关的神经发生发育损伤可能有助于区域和细胞对晚期选择性神经变性的脆弱性。试验者采用光发生学和电生理学方法，从小鼠离体大脑切片上研究了纹状体突触传递。结果发现HD小鼠模型中，纹状体突触传递与突触前膜GABA释放的数量增加并无明显关联，而是与GABA释放后的突触部位反应增强有关，快速激活或抑制可为急性纠正神经元的异常活动提供治疗干预方法。利用光遗传学技术抑制纹状体GABA神经元活动，可见内皮细胞对碱性成纤维细胞生长因子的表达增加，并减少脑萎缩量，促使神经细胞活动趋于正常，HD相关的异常活动恢复正常。因此光遗传学为治疗亨廷顿舞蹈症提供了新思路。

3 小 结

尽管光遗传学具有巨大潜力，但光遗传学仍存在局限性和挑战性，必须加以考虑和解决。在大脑内部，光的传输通常是通过手术将光纤插入特定区域来实现的。侵入性手术不可避免地会导致脑部损伤和不良反应的产生，如感染和出血等。一项研究成功地证明，上转换纳米粒子（UCNP）可以吸收大脑外部发射的近红外光，从而将其转换为可见光的局部发射并刺激大脑的深层结构。UCNP技术将使得微创光学神经元活动的操纵具有远程治疗的潜力。Chen[39]最近的研究表明使用强效的视紫红质ChRmine来实现经定义的神经回路（包括中脑和脑干结构）的经颅光刺激，在前所未有的深度达到7 mm时达到毫秒级。并且使用ChRmine的全身性病毒传递，可以无须手术即可演示行为调节，从而实现无植入物的脑深部的光遗传学。

目前，光遗传学技术现在中枢神经系统疾病治疗上面临的主要障碍是从临床前研究到临床应用的转变，从疾病模型到临床患者的转变。目前主要面临以下几个问题：①光遗传学中使用的视蛋白是外源蛋白，而外源蛋白在大脑中的长期表达引起了人们对免疫原性的关注。②尽管病毒载体如AAV是一种依赖病毒，意味着仅靠它无法产生感染。但病毒载体仍具有抗原性，会使机体产生免疫反应。③光刺激方式在中枢神经疾病患者治疗上的选择。光遗传学未来继续发展的主要方向可以集中在：视蛋白变体的发现和对已知视蛋白的改造，争取可以使较低强度或较长波长的光以进入更深的组织区域。探索更具有细胞靶向性的载体，使得视蛋白能够更准确地在特定神经元上表达。探索类似于上转换纳米颗粒的光遗传学工具，以满足深层的组织穿透深度和低的光热效应。中枢神经系统治疗中光遗传闭环系统的敏感性与稳定性。尽管光遗传学在临床上应用仍有许多挑战，但对于它的前景仍然充满憧憬。