慢性胰腺炎转基因小鼠模型的研究进展

刘俊岑 刘牧云 安薇 孙晓茹 马立哲 吕顺莉 孙畅

1海军军医大学第一附属医院消化内科，上海 200433；2海军第905医院消化内科，上海 200050

【提要】 为进一步探索慢性胰腺炎易感基因及其致病机制，研究者需准确地构建转基因动物模型，掌握不同动物模型的优劣。本文总结几种慢性胰腺炎转基因小鼠模型及其病理表现，探讨转基因小鼠在慢性胰腺炎机制研究中的应用价值。

CP是由基因、环境及其他多种因素引起的以胰腺纤维化和炎症反应为特征的一种进行性慢性疾病[1]。患者常伴随腹痛、腹泻、消瘦、黄疸等临床表现，可出现胰源性门静脉高压、假性囊肿、胆道或十二指肠梗阻等并发症，需要接受药物、内镜甚至外科手术治疗。CP是胰腺癌的危险因素，其中又以遗传性CP发生胰腺癌的风险最高[2]。遗憾的是，目前并没有阻止或逆转CP进展的有效药物问世。由于致病基因多样、致病机制复杂，研究者们尚不能完全掌握CP 的发生和发展机制，因此准确地构建动物模型十分必要。

转基因动物是利用转基因技术将外源基因稳定整合到动物受体的细胞基因组中得来的。转基因技术包括目的基因的构建、筛选载体与受体、基因导入、体外培养等步骤。基因打靶技术属于转基因技术，其实质是同源重组及基因的置换和定点突变，有小鼠胚胎干细胞打靶技术和成簇规律间隔短回文重复序列核酸酶技术(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nucleases，CRISPR/Cas9)等。胚胎干细胞打靶技术是通过同源重组将目的基因打入胚胎干细胞中，并将胚胎干细胞注入囊胚中形成嵌合胚胎，再将其注入假孕小鼠体内形成嵌合体小鼠，嵌合体小鼠与野生型小鼠交配构建动物模型[3]。基因打靶技术中构建目的基因常用的基因敲除方法包括利用基因同源重组进行基因敲除[4]或以Cre/loxp系统为基础的诱导性基因敲除方法[5]。而CRISPR/Cas9技术则是以Cas9蛋白和小向导RNA(sgRNA)为主，通过同源介导的双链DNA修复引入外源DNA片段[6]。本文介绍几种近年已发表的转基因小鼠CP模型。

一、阳离子胰蛋白酶原突变(PRSS1)基因相关突变介导的胰腺炎模型

PRSS1突变使胰酶提前激活，引发自身消化导致遗传性胰腺炎[7]。PRSS1R122H是该功能获得性突变的一种常见突变[8]。Gui等[9]利用Galk介导的重组工程技术，将R122H突变导入含有人PRSS1全长基因的细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)中，通过原核注射BAC克隆获得PRSS1R122H转基因小鼠，并经反复腹腔注射雨蛙素建立CP模型。与对照组C57BL/6小鼠相比，PRSS1R122H转基因小鼠腺泡细胞丢失、纤维化、腺泡-脂肪细胞转化、胰腺上皮内瘤变(precancerous pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN))明显，细胞间隙纤维蛋白沉积增加，凝血酶表达活跃，提示PRSS1R122H转基因小鼠不可自发而需在胆碱凝集素或雨蛙素刺激下才能形成CP，与携带PRSS1R122H基因的儿童不会在10岁前发病，即需要外界刺激这一临床观察结果一致。同时该研究进一步证实联合使用抗凝剂与抗胰蛋白酶药物可显著改善小鼠CP。Huang等[10]使用Cre/loxp系统构建PRSS1R122H小鼠。结果表明，无论以高脂(LPS)饲养还是酒精饲养的PRSS1R122H小鼠胰腺炎症反应较同样饲养方式的PRSS1小鼠或野生型小鼠更重。该模型的致病机制为上调小鼠热休克蛋白(Heat shock protein 70, HSP70)、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)的表达，下调小鼠糜蛋白酶C(chymotrypsin C,CTRC)表达，共同导致DNA损伤、凋亡、胶原沉积等。这一小鼠模型可用于研究脂多糖、乙醇或高脂饮食诱发胰腺炎的机制。Tan等[11]向PRSS1Tg小鼠(丝氨酸蛋白酶1转基因小鼠)腹腔反复注射雨蛙素诱导CP，野生型C57BL/6J小鼠作为对照组。结果表明，与野生型小鼠比较，PRSS1Tg小鼠胰腺组织内炎细胞浸润及细胞间质增多，腺泡线粒体肿胀、核固缩和内质网破坏明显，炎症细胞因子IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平显著升高。由此可见，雨蛙素处理的PRSS1Tg小鼠比野生型小鼠能够更好地模拟人类CP进展，可以作为胰腺炎发病机制研究的模型。在另一项研究中， Jancsó等[12]构建携带小鼠胰蛋白酶原T7亚型突变的pTrapT7-intein-mouse-T7质粒，通过同源重组在野生型小鼠C57BL/6N胚胎干细胞中插入c.71A>G(p.K24R) 突变，最后得到与人类PRSS1突变p.K23R相似的P.K24R突变的T7K24R小鼠。结果发现，T7K24R小鼠的胰蛋白酶原自激活速度是野生型小鼠的5倍，但T7K24R小鼠不会自发形成CP。在雨蛙素反复注射后3 d后，T7K24R小鼠出现腺泡细胞丢失、炎细胞浸润、弥散纤维化以及胰腺重量减轻等CP病理特征；10 d后，C57BL/6N小鼠胰腺组织基本恢复正常，而T7K24R小鼠CP明显加重。可见这种PRSS1突变模型对外界刺激较敏感，可以在明确的时间点被诱导CP起病。

二、阴离子胰蛋白酶原(PRSS2)基因相关突变介导的胰腺炎模型

PRSS2是人胰腺分泌的常见亚型，其高比例表达与胰腺炎相关[13]。Wan[14]等利用BAC构建了PRSS2转基因小鼠，一部分PRSS2小鼠出现自发性局灶性胰腺炎症，雨蛙素刺激下全部PRSS2小鼠进展为CP；野生型C57BL小鼠无CP病理改变。这种PRSS2小鼠模型可测试特异性胰蛋白酶原亚型优势的效应。为进一步明确细胞内胰蛋白酶原激活的生物学作用，有研究使用大鼠PRSS2基因培育了成对碱性氨基酸裂解酶(paired basic amino acid-cleaving enzyme ，PACE)-胰蛋白酶原(Try)转基因小鼠品系。结果表明，PACE-胰蛋白酶原激活可致腺泡细胞死亡，不导致纤维化或CP[15]。此模型适用于降低胰酶活性药物的临床前评估。Zhan等[16]将Try小鼠与BAC小鼠杂交，得到胰腺腺泡细胞中PACE-胰蛋白酶原(Try/BAC)的特异性靶向表达。将对照小鼠CreERT(BAC)与Prss2(Try/BAC)小鼠均使用雨蛙素反复腹腔注射诱导CP，结果显示，与BAC小鼠相比，Try/BAC小鼠的胰酶活性显著增加。6周后，BAC小鼠无CP病理改变，而所有Try/BAC小鼠胰腺组织CP病理改变明显。该动物模型有助于进一步认识胰蛋白酶原不同亚型在发病机制中的作用及促进CP治疗方法的更新。

三、丝氨酸转肽酶抑制因子Kazal 1型(SPINK1)基因相关突变介导的胰腺炎模型

SPINK1蛋白是胰腺腺泡细胞分泌的一种抗蛋白酶，可延缓胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶的自激活级联反应[17]。笔者所在课题组前期研究发现，在中国人群中SPINK1c.194+2T>C功能丧失型突变可能与特发性CP有关，使患者糖尿病发病时间提前[18]。携带c.194+2T>c突变的患者内镜治疗不能明显缓解腹痛，内分泌功能可持续恶化[19]。笔者所在课题组选择C57BL/6小鼠Spink1基因为靶点，使用CRISPR/Cas技术孵育基因敲入小鼠(KI小鼠)，c.194+2T>C突变消除Spink1的表达，定义为Spink1+/-小鼠。Spink1+/-小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配，产生Spink1+/-和Spink1+/+(野生型)小鼠。结果发现，Spink1-/-(纯合突变)小鼠出生即死亡，Spink1+/-小鼠在没有外界刺激下可自发形成CP。腹腔注射雨蛙素后Spink1+/-小鼠胰腺更早出现蛋白栓、腺泡细胞萎缩、腺泡导管细胞组织转化等病理改变，并且比Spink1+/+(野生型)小鼠更为严重[20]。该模型是进一步研究CP发病机制和潜在治疗靶点的理想模型，也是研究CP胰腺钙化形成的新模型。

四、蛋白酶家族基因突变胰腺炎模型

糜蛋白酶原(chymotrypsinogen, CTR)通过降解胰蛋白酶原保护胰腺。研究表明，CTRB1-CTRB2基因座倒位影响胰蛋白酶原PRSS1降解，增加了欧洲人酒精性与非酒精性CP风险[21]，而在中国人群中则不致病[22]。Jancso等[23]为了证实糜蛋白酶对小鼠的保护作用，在C57BL/6N小鼠中使用CRISPR-Cas9的基因组编辑构建Ctrb1基因敲除小鼠模型。结果表明，在雨蛙素诱导下Ctrb1基因敲除小鼠胰腺炎症较重，糜蛋白酶活性无明显变化，而对照组C57BL/6N小鼠糜蛋白酶活性增加。提示临床治疗胰腺炎时，需靶向抗胰蛋白酶，保留糜蛋白酶活性。该模型为新药的研制提供了理论基础。CTRC是另一种糜蛋白酶亚型，能够降解胰蛋白酶原，抑制胰蛋白酶激活。Geisz等[24]发现近交系C57BL/6小鼠由于自然单核苷酸缺失而不表达功能性Ctrc，他们采用标记辅助回交法选择性地培育出正常Ctrc基因座的小鼠，并通过腹腔注射雨蛙素建立C57BL/6小鼠与Ctrc+小鼠CP模型。结果发现相比于C57BL/6N小鼠，Ctrc+小鼠CP严重程度明显较轻。该动物模型证实Ctrc对啮齿类动物胰腺炎的发病与进展有保护作用，进一步阐明了C57BL/6小鼠是人类CTRC功能丧失型突变的天然模型。

五、羧肽酶A1(CPA1)基因相关突变介导的胰腺炎模型

CPA1是一种金属蛋白酶，能水解肽键[25]，其基因突变导致CPA1蛋白错误折叠，从而导致内质网应激致病。Hegyi等[26]通过同源重组把人类CPA1突变p.N256K敲入C57BL/6N小鼠Cpa1位点构建转基因小鼠模型。结果证实CPA1N256K突变引起小鼠CPA1蛋白错误折叠、内质网应激，表现为6月龄时腺泡萎缩、炎症细胞浸润明显，胰腺重量减轻35%～40%，这是一种自发形成的进行性的CP。这种错误折叠导致的胰腺炎小鼠模型有潜在的临床前用途；更可以测试在CP疾病进展中，各种环境因素如酒精、烟草、高脂饮食、药物等对疾病进程的影响。Orekhova等[27]使用上述CPA1N256K小鼠品系，分别予含5%乙醇的酒精饮食和对照流食喂养，4周后处死。结果显示，酒精喂养2～3周后部分CPA1N256K小鼠因癫痫发作死亡，流质饮食喂养的CPA1N256K小鼠未出现癫痫发作及死亡。CPA1N256K小鼠(包括酒精饮食及对照流质饮食)的血清淀粉酶水平均高于对照组C57BL/6N小鼠，胰腺重量低于C57BL/6N小鼠。酒精喂养的CPA1N256K小鼠胰腺腺泡细胞损伤面积是对照饮食小鼠的2倍，且巨噬细胞浸润、胰腺纤维化明显。而C57BL/6N小鼠无论是酒精饮食还是对照流质饮食均未出现癫痫发作及胰腺纤维化。该研究证实了酒精与CPA1突变能协同促进内质网应激，加速CPA1N256K小鼠CP的疾病进展，但可导致小鼠突然死亡，提前终止实验，可能无法达到预期实验效果。

六、导管细胞中肝细胞核因子1 B(HNF1B)基因相关突变介导的胰腺炎模型

HNF1B基因突变可导致胰腺外分泌功能障碍，促进CP形成[28]。Quilichini等[29]构建了Hnf1b△duct小鼠，经他莫昔芬腹腔注射构建导管细胞Hnf1b缺失模型，并以Hnf1bfl/+或Hnf1bfl/fl小鼠为对照组。结果显示，2个月后，Hnf1b△duct小鼠胰腺有CP表现(炎细胞浸润、腺泡萎缩、胰腺星状细胞激活、纤维化形成等)，胰腺重量下降约43%，并随时间延长小鼠体重下降更明显。该动物模型既证实了胰腺导管细胞Hnf1b缺陷可导致胰腺外分泌功能障碍，又为深入研究CP发病机制提供可靠的模型。为进一步研究5型糖尿病患者的胰腺情况，有研究者使用人HNF1B基因构建Hnf1bsp2/+小鼠，发现Hnf1bsp2/+小鼠可出现外分泌功能障碍、CP等病理特征[30]。此小鼠为内外分泌功能丧失的分子研究提供了活体模型。

七、弹性蛋白酶相关突变介导的胰腺炎模型

人糜蛋白酶样弹性蛋白酶3B(Chymotrypsin-like elastase family member 3B，CELA3B)属于弹性蛋白酶，被胰酶切割后转化为活性蛋白酶。CELA3Bc.268C>T(p.R90C)突变移除分子刹车后增加CELA3B蛋白酶翻译和分泌，增强其在胰蛋白酶作用下的蛋白分解活性。该突变与家族性胰腺炎有关。Moore等[31]采用CRISPR-Cas9技术敲入小鼠内源性Cela3b基因座的同源突变(R89C和R89L)，后将其注射到C57BL/6受精卵中。结果表明，Cela3b纯合子突变小鼠(R89C/R89C和R89L/R89L)在40周龄时未发生胰腺炎。在雨蛙素的作用下，纯合子Cela3b突变小鼠相较于野生型小鼠产生了更严重的胰腺炎，且R89L小鼠比R89C小鼠严重(免疫细胞浸润、腺泡去分化、小叶完整性丧失更明显)。故目前的学说更支持2次打击理论，即CELA3B基因突变增加胰腺对外界损伤的易感性。进一步测序确定该突变可能的致病机制，即精氨酸90突变成半胱氨酸。此突变虽未改变CELA3B的催化特性，但提高其翻译速率，增加活性酶的数量，提高因胰腺损伤引起胰腺炎的风险。该小鼠模型体现了CELA3B在胰腺炎中的重要致病作用，其潜在的催化特性和增强致病性的能力可能与重症胰腺炎有关。

八、自身免疫性胰腺炎(AIP)小鼠模型

AIP与机体免疫机制异常相关，如免疫球蛋白亚型4(IgG4)水平升高[32-33]。Jaster等[34]将3种自发自身免疫性疾病MRL/MpJ(AIP)、NZM2410/J(狼疮)和BXD2/TyJ(关节炎)的亲代小鼠品系与不易发生任何自身免疫性疾病的CAST/EIJ小鼠进行杂交，得到具有自身免疫倾向的高级交叉小鼠(advanced intercross mouse ，AIL)系。AIL小鼠可自发形成AIP。Seleznik等[35]为了验证淋巴毒素(lymphotoxin，LT)α、β在人AIP中的作用，构建腺泡细胞内高表达LTα、β的Tg(Ela1-Lta,b)小鼠。Wanner-Seleznik等[36]发现Tg(Ela1-Lta,b)小鼠具备了人类AIP的多种特征，包括抗胰腺自身抗原Abs、抗核抗体、血清IgG升高以及IgG在肾脏沉积等表现，小鼠9～12月龄自发形成AIP。提示AIP小鼠体内T细胞、B细胞、巨噬细胞大量聚集，靶向CD20、CD4治疗后小鼠胰腺的病理损害明显改善，胰腺小叶更完整。该小鼠模型是一种与病因学相关的自发性起病的临床前动物模型，为研究AIP发病机制和治疗方法的提供了理想模型。

九、瞬时受体电位香草酸亚家族成员6(TRPV6)基因相关突变介导的CP模型

TRPV6是早发型CP患者的功能缺失性突变，是一种结构性激活的Ca2+选择性离子通道，属于瞬时受体电位通道的香草素亚家族[37]。Masamune等[38]选取了8～10周龄的表达人TRPV6基因的TRPV6mut/mut小鼠， 其Ca2+渗透相关的区域中单个天冬氨酸残基被丙氨酸取代。结果提示，与野生型小鼠相比，TRPV6mut/mut小鼠有典型CP病理特征(腺泡细胞丢失、淀粉酶脂肪酶分泌减少、纤维化增加、ADM)。该模型不仅表明了TRPV6是一种新的胰腺炎相关基因， 还展示了Ca2+通道在胰腺炎中有致病作用，对促进新药开发有重要作用。

综上所述，转基因小鼠模型符合临床发病机制，贴合自然病程，对其构建及研究有利于进一步了解CP的发病机制，同时也为CP治疗药物的研发提供新思路。

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