基于传统煎煮方法的吴茱萸标准汤剂质量标准研究

张伟娜，李雪，刘书霞，周永康，杜守颖

1.北京康仁堂药业有限公司/中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心/北京市中药配方颗粒工程技术研究中心，北京 101300；

2.北京中医药大学 中药学院，北京 102488

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛 吴茱萸E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang 的干燥近成熟果实［1］。其性热，味辛、苦，有小毒，归肝、脾、胃、肾经。吴茱萸具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻之功效，临床用于厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸、五更泄泻、慢性胆囊炎、消化性溃疡、慢性浅表性胃炎、神经官能症、眩晕、头痛、高血压等症［1-2］。吴茱萸始载于《神农本草经》，列为中品，又名吴萸、茶辣、臭辣子树、曲药子、伏辣子，是我国常用的大宗中药材，在我国分布广、适应性强、变种多。王承南等［3］通过对3 个基原吴茱萸进行考察，发现其有效成分含量有显著差异。3 个基原中，药用有效成分（吴茱萸碱和吴茱萸次碱）成分含量吴茱萸最高，石虎次之，疏毛吴茱萸最低。为保证成品质量的稳定，需对基原固化。综合应用历史、产地分布、质量、产量等因素，本研究对象为芸香科植物吴茱萸。

吴茱萸的化学成分较复杂，主要包括生物碱类、苦味素、黄酮类、萜类、香豆素类、木脂素类、甾体类、挥发油和有机酸类化合物，其中生物碱和苦味素是吴茱萸的主要化学成分，目前对生物碱的研究较深入。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版将吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素作为吴茱萸质量的评价指标。

中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒，在中医药理论指导下，按照中医临床处方配方后，供患者冲服使用，其临床疗效应当和相应的饮片保持一致。为加强中药配方颗粒质量管理，国家药品监督管理局2021 年1 月公布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》［4］，明确了标准汤剂为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的物质基准。中药标准汤剂为遵循中医药理论，由不少于15 批有代表性的原料，经炮制加工后，分别按照临床汤剂煎煮方法规范化煎煮，固液分离，经适当浓缩制得或经适宜方法干燥制得。

本研究以传统汤剂的煎煮方法为基准，建立以出膏率和指标成分柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的转移率为评价指标的质量标准，为吴茱萸配方颗粒标准制定提供参考。

1 材料

1.1 仪器

微电脑陶瓷煎药壶（永达基电器厂）；ACQUITY UPLC®H-Class 型超高效液相色谱仪、TUV Detector型检测器（Waters 公司）；ME104E 型电子天平、XP-26 型电子天平［梅特勒托利多仪器（上海）有限公司］；JY20002 型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；BSA124S 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；KQ-500DB 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；硅胶G薄层板（烟台市化学工业研究所、烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂）。

1.2 试药

对照品柠檬苦素（批号：110800-201707，纯度：97.9%）、吴茱萸碱（批号：110802-201710，纯度：99.6%）、吴茱萸次碱（批号：110801-201608，纯度：99.7%）、吴茱萸药材（批号：120909-201510）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、磷酸均为色谱纯；甲醇、乙醇均为分析纯；蒸馏水。

本研究收集的3 个主产地和道地产区共15 批吴茱萸药材经王孝涛传承工作室制药工程师于立伟鉴定为中药吴茱萸，经过DNA 条形码检测均为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.。经炮制后制成15 批吴茱萸饮片，按照《中国药典》2020年版检测，均符合规定。

15批吴茱萸药材信息见表1。

表1 吴茱萸药材产地信息

2 方法与结果

2.1 标准汤剂

依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》［4］和《医疗机构中药煎药室管理规范》［5］中相关要求制备吴茱萸标准汤剂。

取吴茱萸，置于陶瓷煎药壶中，浸泡30 min，一煎加入饮片8倍量水，武火煮沸后，文火煎煮30 min，趁热滤过，冷却，备用；二煎加饮片6 倍量水，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁热滤过，冷却，合并两煎滤液，作为吴茱萸标准汤剂。吴茱萸标准汤剂低温减压浓缩（50 ℃）至料液比约为1∶1，冷冻干燥，得吴茱萸标准汤剂冻干粉。

15 批吴茱萸饮片按照上述方法制备标准汤剂和标准汤剂冻干粉。

2.2 薄层色谱鉴别

考虑到吴茱萸标准汤剂是由吴茱萸经水煎煮制得，水溶性成分较多，《中国药典》2020 年版及相关文献［6-8］所载方法多用于偏小极性成分分析，需增加水溶性成分的定性鉴别。本鉴别方法根据《中国药典》2020 年版吴茱萸项下薄层鉴别方法和相关文献所载方法［6-8］，经实验研究优化制定，选用吴茱萸碱、吴茱萸次减、吴茱萸对照药材水煮处理品作为对照，采用二次展开的方式进行检视。

取标准汤剂冻干粉研细，称取0.5 g，加乙醇10 mL，静置30 min，超声处理30 min，滤过，作为供试品溶液。取吴茱萸对照药材1 g，加水25 mL，煮沸30 min，滤过，蒸干，加乙醇10 mL，超声处理30 min，滤过，作为对照药材溶液。取吴茱萸次碱对照品、吴茱萸碱对照品，加乙醇分别制成质量浓度为0.2、1.5 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。取对照品溶液2 μL、对照药材溶液及供试品溶液各5 μL分别点于同一硅胶G 板上，以正己烷-三氯甲烷-丙酮-甲醇-三乙胺（24∶9∶5.5∶1∶0.4）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，再以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇试液，在105 ℃加热，置紫外光灯（365 nm）下检视。

2.3 指标成分含量测定

2.3.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters ACQUITY UPLC®BEH Shield RP18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～4 min，4%A；4～9 min，4%～11%A；9～10 min，11%A；10～14 min，11%～18%A；14～20 min，18%～35%A；20～26 min，35%～40%A；26～30 min，40%A；30～31 min，40%～80%A；31～33 min，80%A；33～34 min，80%～4%A）；检测波长为225 nm；柱温为35 ℃；流速为0.4 mL·min-1；进样量为1 μL。

2.3.2 对照品溶液制备 取柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为160、25、15 μg·mL-1的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液制备 取研细的样品约0.2 g，精密称定，精密加入甲醇10 mL，称定质量，超声处理20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 含量测定方法学

2.3.4.1 精密度试验 取吴茱萸标准汤剂冻干粉（WZY-07）6 份，按2.3.1 项下方法测定。结果柠檬苦素含量的RSD 为0.98%，吴茱萸碱含量的RSD 为0.62%，吴茱萸次碱含量的RSD 为0.56%，表明精密度良好。

不同分析人员在不同时间取吴茱萸标准汤剂冻干粉（WZY-07）6 份，用不同仪器按照2.3.1 项下方法进行中间精密度试验。结果柠檬苦素含量的RSD 为1.08%，吴茱萸碱含量的RSD 为1.47%，吴茱萸次碱含量的RSD 为3.38%，符合方法学验证精密度要求。

2.3.4.2 加样回收率试验 精密称取已知指标成分含量的吴茱萸标准汤剂冻干粉0.1 g，分别精密加入0.5、1、1.5 倍量柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品，按2.3.3 项下方法制备供试品溶液，按2.3.1 项下色谱条件测定，计算平均加样回收率，结果柠檬苦素平均回收率为97.44%，RSD 为3.86%，吴茱萸碱的平均回收率为100.30%，RSD为3.49%，吴茱萸次碱的平均回收率为102.14%，RSD为2.99%（表2）。

表2 吴茱萸中柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱加样回收率试验结果

2.3.4.3 线性关系考察 取柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为600、100、32 μg·mL-1的溶液，作为混合对照品母液。分别精密吸取对照品母液1、3、5、10 mL，置于20 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过；精密吸取上述续滤液及母液1 μL，注入超高效液相色谱仪，按2.3.1项下条件分别测定。以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得柠檬苦素回归方程：Y=586.17X+1 939.5（r=0.999 80），在29.705～594.096 μg·mL-1线性良好；吴茱萸碱回归方程：Y=34 566X+11 015（r=1.000 0），在5.139～102.787 μg·mL-1线性良好；吴茱萸次碱回归方程：Y=18 198X+8 317.7（r=0.999 9），在1.566～31.316 μg·mL-1线性良好。

2.3.4.4 稳定性试验 取吴茱萸标准汤剂冻干粉，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按照2.3.1 项下方法进行测定。24 h 内柠檬苦素峰的峰面积RSD 为1.74%；吴茱萸碱峰的峰面积RSD 为0.91%；吴茱萸次碱的峰面积RSD为0.69%，表明该方法在24 h内稳定性良好。

2.4 样品测定

2.4.1 出膏率及pH 将2.1 项下标准汤剂称质量，摇匀后称取出总药液质量的约1/10，称定质量，置于质量恒定的蒸发皿中，水浴蒸干，置于105 ℃电热鼓风干燥箱中，干燥6 h后，取出，于干燥器中放至室温，称质量，计算出膏率。15 批标准汤剂出膏率为26.15%～28.79%，平均出膏率为27.75%，见表3。

表3 吴茱萸标准汤剂冻干粉3个成分质量分数及转移率

使用pH 计测定2.1 项下标准汤剂的pH，15 批标准汤剂pH 均值为5.39，RSD 为3.92%，各批次间差异不大，均为酸性溶液。

2.4.2 薄层色谱鉴别

2.4.2.1 不同温、湿度考察 分别吸取吴茱萸标准汤剂冻干粉供试品、吴茱萸对照药材、吴茱萸碱对照品及吴茱萸次碱对照品溶液，点于同一硅胶G 薄层板上，分别在5～15、20～35 ℃ 2 个温度区间，10%～30%、75%～90%2 个相对湿度条件下展开，取出，晾干，显色，在紫外灯下（365 nm）检视，薄层色谱图见图1～4。

图1 常温常湿下吴茱萸标准汤剂冻干粉薄层鉴别

图2 低温常湿下吴茱萸标准汤剂冻干粉薄层鉴别

图3 常温低湿下吴茱萸标准汤剂冻干粉薄层鉴别

图4 常温高湿下吴茱萸标准汤剂冻干粉薄层鉴别

2.4.2.2 不同厂家薄层板考察 分别采用不同厂家生产的硅胶G薄层板，按薄层条件展开，结果见图5～6。

图5 不同硅胶G薄层板（烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂）薄层鉴别图

图6 不同硅胶G薄层板（青岛海洋）薄层鉴别

2.4.2.3 样品测定 15 批吴茱萸标准汤剂冻干粉按照2.2 项下方法检测，薄层色谱图信息全面，斑点清晰，第一次展开在与对照品相应的位置显相同颜色的斑点，第二次展开在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。各批均能实现良好的分离效果。结果见图7～8。

图7 15批吴茱萸标准汤剂冻干粉一次展开薄层鉴别

图8 15批吴茱萸标准汤剂冻干粉二次展开薄层鉴别

2.4.3 指标成分含量及转移率 15 批标准汤剂冻干粉按照2.3 项下方法检测，计算各样品中柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的含量及转移率。15 批吴茱萸标准汤剂冻干粉中柠檬苦素平均质量分数为0.60%，实测为0.45%～0.71%，吴茱萸碱平均质量分数为0.19%，实测为0.11%～0.29%。吴茱萸次碱平均质量分数为0.058%，实测为0.049%～0.062%，结果见图9、表3。

图9 吴茱萸标准汤剂含量测定色谱图

3 分析与讨论

吴茱萸属于芸香科植物的果实，味辛，气芳香。本课题组在研究前，对15 批标准汤剂提取液进行提取，均未收集到挥发油，可能与吴茱萸本身挥发油含量不高有关。据文献报道，吴茱萸中挥发油质量分数为0.05%～3.80%［9］，经过煎煮后挥发油受热挥发，水煎液中几乎不含挥发油，而且吴茱萸中挥发油常被认为具急性毒性，且主要是肝毒性［10-13］，是需要去除的。综上分析，吴茱萸仍按照一般果实种

子类标准汤剂制备方法制备，即2.1项下方法。

经SPSS Statistics 20 数理统计分析，15 批吴茱萸标准汤剂出膏率、指标成分转移率数据均无离散值，差异有统计学意义。出膏率均值为27.75%，RSD 为2.59%，柠檬苦素转移率均值为26.10%，RSD 为15.80%；吴茱萸碱转移率均值为2.82%，RSD 为19.64%；吴茱萸次碱转移率均值为3.76%，RSD 为26.18%。15 批吴茱萸标准汤剂冻干粉出膏率分布范围相对集中；柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱转移率分布范围相对离散，表明不同产地、不同规格的吴茱萸标准汤剂出膏率差别不大，含量及转移率差异较大。

15 批标准汤剂pH 为5.1～6.0，说明吴茱萸水煎液为弱酸性溶液。推测与其他药物配伍可能有助于其中碱性成分溶出。

吴茱萸标准汤剂为吴茱萸的水煎液，薄层色谱鉴别时先选用正己烷-三氯甲烷-丙酮-甲醇-三乙胺展开系统，展开，以吴茱萸碱、吴茱萸次碱为对照，检视其中小极性成分，再以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开系统，展开，以吴茱萸对照药材为对照，检视其中等极性和大极性成分。按照该方法检测，指标成分分离度较好，比移值（Rf）适当，供试品与对照品、对照药材斑点对应、耐用性好，对比《中国药典》2020 年版薄层色谱鉴别方法，该方法可同时鉴别小极性、中等极性和大极性成分。吴茱萸碱对照品在第二次展开中有时会有3 个荧光斑点，分析造成这一现象的原因有以下几点：1）吴茱萸碱物理性质为微溶于乙醇，配制对照品时需超声处理1 h左右才能全部溶解，超声过程中产热可能会导致其分解。2）对照品溶液为1 个月前配制，推测有可能在储存过程中已有部分分解。3）二次展开系统为酸性系统，不稳定，但在液相色谱中未检测到其他色谱峰，因此吴茱萸碱存储过程中分解的可能性不大。推测是吴茱萸碱与展开剂发生了反应或在展开剂中分布不均匀，需进一步研究确定。

色谱条件考察中尝试了乙腈-0.1%甲酸系统，峰堆积较严重，更换甲醇-0.1%甲酸系统，基线波动较大，更换乙腈-0.1%磷酸系统，基线波动小，调整流动相梯度，最终所得色谱图峰谱信息量较大，分离效果较佳，3 个指标成分峰形好，分离效果好。而且该方法可同时检视吴茱萸标准汤剂冻干粉中小极性、中极性、大极性成分，也是吴茱萸标准汤剂冻干粉的特征图谱检测方法。供试品制备方法中考察了提取溶剂的种类和提取时间、提取方式，分别比较了以甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水为溶剂时的提取效果，发现以甲醇为提取溶剂提取效果最好，而回流和超声提取方式及超声时间对提取效果影响不大，因此确定供试品溶液的制备方法为甲醇超声30 min。

15批吴茱萸标准汤剂冻干粉是在中医药理论指导下按照传统汤剂煎煮方法规范化煎煮，固液分离，经适当浓缩制得或经适宜方法干燥制得的。15批吴茱萸药材来自不同的主产区和道地产区，标准汤剂煎煮选用传统陶瓷煎药壶，热源选用微电脑控制面板的电炉，煎煮工艺统一。选用出膏率、薄层色谱鉴别和柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱3个指标成分含量作为吴茱萸配方颗粒质量控制指标，方法严谨。该质量标准研究可为吴茱萸配方颗粒的质量控制、工艺研究和含吴茱萸的中药经典名方开发提供参考。