液态乳制品中乳清蛋白和酪蛋白含量分析

孔凡华，赵笑，李宏，白沙沙，杨春雪，孙晓辰，富宏坤，侯君钊，崔亚娟*

1(北京市营养源研究所有限公司，北京，100069)2(中国合格评定国家认可中心，北京，100062)3(北京联合大学 自动化学院，北京，100101)

乳及乳制品是人体重要的蛋白质来源，乳蛋白是牛乳中最有营养价值的部分。牛乳中约含有2.2%～4.4%的蛋白质，主要包括乳清蛋白、酪蛋白及少量脂肪球膜蛋白等[1]。乳清蛋白由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、糖肽、牛血清白蛋白和次要蛋白(如乳过氧化物酶、溶菌酶、骨桥蛋白和乳铁蛋白)组成[2]。乳清蛋白具有重要的营养价值和生物学效价[3]，是公认的人体优质蛋白质补充剂之一。β-乳球蛋白是由乳腺上皮细胞合成的乳特有蛋白质，约占乳清蛋白总量的50%[4]。β-乳球蛋白具备最佳的氨基酸比例，支链氨基酸含量极高，有降低胆固醇、抗氧化、易被吸收、促进脂溶性营养素(如维生素A和维生素E)吸收等作用[5-6]，被认为是多功能蛋白。α-乳白蛋白占牛乳清蛋白的20%左右，作为辅酶参与乳糖的生物合成[3]，是泌乳阶段的一个重要调节因子，也是必需氨基酸色氨酸和半胱氨酸的良好供体[7]。乳铁蛋白是乳清蛋白中的一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有独特的结构和生物学功能，在强化机体铁吸收、对抗病原体、免疫调节及抗氧化等方面发挥着重要的作用[8-10]。骨桥蛋白是一种多功能磷酸化糖蛋白，参与细胞迁移、生存、炎症反应和肿瘤转移等生理活动[11]。骨桥蛋白也是心室重塑过程中的重要糖蛋白，它通过影响炎症反应，调节细胞外基质表达及肾素—血管紧张素—醛固酮系统，可进一步影响心室重塑[12-13]。酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质[14]，约占牛乳蛋白含量的76%～86%，是由乳腺上皮细胞合成的一种含有大量钙和磷的蛋白，以胶束形式存在于牛乳中[15]。牛乳含有4种酪蛋白，分别为αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白[16]。酪蛋白中包含多种人体必需的氨基酸，水解后可产生血管紧张素转移酶抑制肽、抗氧化肽、抗疲劳肽等功能肽段[17]，同时，可以促进Ca2+、Zn2+等离子吸收[18]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

市售风味发酵乳和风味酸乳共计13种，分别为A品牌炭烧风味发酵乳、B品牌益菌多风味发酵乳(原味)、C品牌炭烧风味发酵乳(黄桃口味)、H品牌益生菌酸牛奶、I品牌原味酸牛奶、J品牌复原乳风味发酵乳、B品牌风味酸牛奶、B品牌风味酸牛奶(原味)、C品牌复原乳风味酸牛奶(原味)、D品牌老酸奶风味酸牛奶、G品牌浓缩酸奶、G品牌熟酸奶和H品牌罐酸奶；其他液态乳共计15种，分别为B品牌鲜牛乳、C品牌鲜牛奶、E品牌纯牛奶、B品牌脱脂鲜牛奶、A品牌纯牛奶、A品牌优选纯牛奶、C品牌纯牛奶、D品牌纯牛奶、E品牌牛乳、F品牌纯牛奶、F品牌100%纯牛奶、D品牌悦鲜活牛奶、K品牌奶糖风味牛奶、L品牌山羊奶、M品牌纯羊奶。液态乳样品采集后4 ℃保存，3 d内测定。

1.2 试剂与仪器

NH4HCO3、CaCl2、乙酸、H2SO4、NaOH(均为分析纯)，北京化工厂；甲酸、乙腈(均为色谱纯)，赛默飞世尔科技有限公司；二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘代乙酰胺(iodoacetamide，IAA)，北京索莱宝科技有限公司；牛胰蛋白酶，美国Sigma公司；特异肽段(纯度≥95%)，宁波康贝生化有限公司。

UPLC I-CLASS XEVO液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪(带电喷雾离子源)，美国Waters公司；BS224S分析天平，德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；QL-901旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；ZHWY-110X30往复式恒温水浴摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；PS-60A超声波振荡器，深圳市深华泰实业有限公司；KJ2300全自动凯氏定氮仪，丹麦FOSS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

称取液态试样10 g于100 mL容量瓶中，加90 mL水充分溶解后定容至刻度，旋涡混合器混合样品。移取1.0 mL上述试样，用水定容至10 mL，经旋涡混合器混合均匀。移取混匀后的试样溶液200 μL于2 mL离心管中，加入150 μL 500 mmol/L NH4HCO3溶液和10 μL 500 mmol/L DTT溶液，混匀后置于75 ℃恒温水浴30 min；冷却至室温，加入30 μL 500 mmol/L IAA溶液，暗处静置30 min；再加入10 μL 100 mmol/L CaCl2溶液和50 μL 500 μg/L牛胰蛋白酶溶液，充分混匀后置于37 ℃恒温水浴中酶解5 h。胰蛋白酶可特异性的酶切赖氨酸和精氨酸位点，生成多条乳蛋白肽段。酶解后向样液中加10 μL甲酸混匀，室温下静置15 min，加入490 μL水，涡旋混匀后，用0.22 μm滤膜过滤，供液相色谱串联质谱仪检测[19]。

1.3.2 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC 300 Protein BEHC4色谱柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)，柱温40 ℃，进样量5 μL，流速0.3 mL/min。

流动相A为0.1%(体积分数，下同)甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱。梯度洗脱程序如下：0～1.5 min，5% B；1.5～2.5 min，5%～38% B；2.5～6.5 min，38%～41% B；6.5～7.6 min，41%～95% B；7.6～8.0 min，保持95% B；8.0～8.1 min，95%～5% B；8.1～10.0 min，5% B[20]。

1.3.3 质谱条件

毛细管电压3.5 kV，锥孔电压35 kV，脱溶剂温度500 ℃，脱溶剂气流量800 L/min，锥孔反吹气流量30 L/h，碰撞室压力0.3 Pa，低端分辨率1∶2.5 V，高端分辨率1∶15.0 V，离子能量1∶0.5，离子源温度150 ℃，提取器压力3.0 V，入口透镜电压0.5 V，碰撞梯度1.0。

α-乳白蛋白分子质量为14 178 Da、β-乳球蛋白分子质量为18 320 Da、骨桥蛋白分子质量为44 000 Da、乳铁蛋白分子质量为76 095.1 Da、αs1-酪蛋白分子质量为23 614 Da、αs2-酪蛋白分子质量为25 230 Da、β-酪蛋白分子质量为23 983 Da、κ-酪蛋白分子质量为19 023 Da，采用特异肽段外标法定量。乳清蛋白和酪蛋白特异肽段谱图见图1。

1.4 计算公式

试样中乳清蛋白含量按照公式(1)计算：

ww=(wα+wβ)/F

(1)

式中：ww，试样中乳清蛋白的含量，g/100 g；wα，试样中α-乳白蛋白的含量，g/100 g；wβ，试样中β-乳球蛋白的含量，g/100 g；F，折算系数，取值0.6。

1.5 数据处理

实验收集到的原始数据经过Excel 2016和SPSS 2.0整理分析。

2 结果与分析

本文采用酶解法同时测定液态乳制品中乳清蛋白和酪蛋白的含量，由表1知，在风味发酵乳和风味酸乳中，α-乳白蛋白含量在49～195 mg/100 g，含量最高的为J品牌复原乳风味发酵乳，含量最低为C品牌炭烧风味发酵乳。β-乳球蛋白含量在108～441 mg/100 g，含量最高的为J品牌复原乳风味发酵乳，含量最低为C品牌炭烧风味发酵乳。骨桥蛋白含量在1.33～3.53 mg/100 g，含量最高的为J品牌复原乳风味发酵乳，含量最低为C品牌复原乳风味酸牛奶。乳铁蛋白含量在0.062～0.342 mg/100 g，含量最高的为B品牌风味酸牛奶，含量最低为D品牌老酸奶风味酸牛奶。乳清蛋白含量在261～1 060 mg/100 g，含量最高的为J品牌复原乳风味发酵乳，含量最低为C品牌炭烧风味发酵乳。

a-α-乳白蛋白；b-β-乳球蛋白；c-骨桥蛋白；d-乳铁蛋白；e-αs1-酪蛋白；f-αs2-酪蛋白；g-β-酪蛋白；h-κ-酪蛋白图1 乳清蛋白和酪蛋白特异肽段谱图Fig.1 Whey protein and casein specific peptide segment spectrum

鲜牛奶和纯牛奶中α-乳白蛋白含量在90～179 mg/100 mL，含量最高的为E品牌牛乳，此样品为高温杀菌乳，含量最低的为K品牌奶糖风味牛奶，此样品为调制乳。β-乳球蛋白含量在199～343 mg/100 mL，含量最高的为E品牌牛乳，此样品为高温杀菌乳，含量最低的为K品牌奶糖风味牛奶，此样品为调制乳。骨桥蛋白含量在3.11～5.72 mg/100 mL，含量最高的为E品牌牛乳，此样品为高温杀菌乳，含量最低的为K品牌奶糖风味牛奶，此样品为调制乳。乳铁蛋白含量在0.039～7.845 mg/100 mL，含量最高的为E品牌牛乳，此样品为高温杀菌乳，含量最低的为A品牌优选纯牛奶，此样品为高温杀菌乳。乳清蛋白含量在486～833 mg/100 mL，含量最高的为E品牌牛乳，此样品为高温杀菌乳，含量最低的为K品牌奶糖风味牛奶，此样品为调制乳。液态乳中酪蛋白主要是β-酪蛋白和αs1-酪蛋白，β-酪蛋白含量整体高于αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白含量相近。鲜牛奶和纯牛奶中4种酪蛋白的含量整体高于风味发酵乳和风味酸乳。在风味发酵乳和风味酸乳中，αs1-酪蛋白含量为0.516～0.968 g/100 g，含量最高的为B品牌益菌多风味发酵乳，含量最低为G品牌熟酸奶。αs2-酪蛋白含量在0.047～0.206 g/100 g，含量最高的为B品牌益菌多风味发酵乳，含量最低为G品牌熟酸奶。β-酪蛋白含量在0.44～1.07 g/100 g，含量最高的为B品牌益菌多风味发酵乳，含量最低为G品牌熟酸奶。κ-酪蛋白含量在0.082～0.298 g/100 g，含量最高的为B品牌益菌多风味发酵乳，含量最低为G品牌熟酸奶。鲜牛奶和纯牛奶中，αs1-酪蛋白含量在0.874～1.083 g/100 mL，含量最高的为E品牌牛乳，此样品为高温杀菌乳，含量最低的为K品牌奶糖风味牛奶，此样品为调制乳。αs2-酪蛋白含量在0.17～0.234 g/100 mL，含量最高的为E品牌牛乳，此样品为高温杀菌乳，含量最低的为K品牌奶糖风味牛奶，此样品为调制乳。β-酪蛋白含量在0.955～1.20 g/100 mL，含量最高的为E品牌牛乳，此样品为高温杀菌乳，含量最低的为K品牌奶糖风味牛奶，此样品为调制乳。液态羊乳中各种功能蛋白的含量和液态牛乳相近。

风味发酵乳和风味酸乳中，B品牌益菌多风味发酵乳和J品牌复原乳风味发酵乳中功能蛋白含量较高，C品牌炭烧风味发酵乳功能蛋白含量较低。鲜牛奶和纯牛奶中，E品牌牛乳(高温杀菌乳)功能蛋白含量较高，K品牌奶糖风味牛奶(调制乳)功能蛋白含量较低。

3 结论与讨论

28种液态乳制品中，乳清蛋白主要是β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，β-乳球蛋白含量整体高于α-乳白蛋白，同时，含有少量的骨桥蛋白和乳铁蛋白。酪蛋白的含量普遍大于乳清蛋白，其中，αs1酪蛋白和β-酪蛋白占比为最高的2种酪蛋白。鲜牛奶和纯牛奶中乳清蛋白和酪蛋白的含量整体高于风味发酵乳和风味酸乳。

28种液态乳制品中，乳清蛋白和酪蛋白含量差异非常显著，这是因为28种液态乳制品中有牛乳、羊乳、复配乳、浓缩乳等不同来源的乳品，可能直接导致了乳清蛋白和酪蛋白的差异。不同液态乳制品的加工处理方式不同，对各种功能蛋白的含量具有显著影响。此外高温杀菌乳、超瞬时杀菌乳贮藏时间的不同可能也会导致蛋白含量的差异性。后续研究应该侧重不同乳来源、不同热处理方式、不同保质期液态乳制品中功能蛋白含量的差异研究。