高效液相色谱-荧光检测器-二级阵列管检测器法测定烤羊肉串中16种多环芳烃

2022-12-26张永胜韩金花田铸张丹张珍师希雄

食品与发酵工业 2022年23期

张永胜，韩金花，田铸，张丹，张珍，师希雄*

1(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州，730070)2(甘肃省干旱生境作物学重点实验室(甘肃农业大学)，甘肃兰州，730070)

我国西北地区的羊肉具有高蛋白、低脂肪、氨基酸和矿物质含量高等特点[1]。羊肉串因独特的色香味和高营养价值受到消费者的喜爱[2]。然而，羊肉串在烤制过程中容易产生多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)和杂环胺等有毒有害物质。PAHs是由两个或两个以上芳香环构成的烃类物质，作为重要的环境和食品污染物，其具有强致畸、致癌和致突变作用，能够引起生物体多个器官的癌变[3]。欧盟委员会国际癌症研究机构、欧洲食品安全局、美国有毒物质与疾病登记机构和我国国标将16种PAHs列为优先控制致癌物[4-6]。

目前，食品中检测PAHs的方法有HPLC和GC-MS法。GC-MS检测时，样品需要气化处理，气化时高温会引起目标物分解的可能，而HPLC可在室温下进行，避免了高温引起目标物分解的可能，且有较高的灵敏性、重现性以及准确度[6-8]。目前，白雪[6]建立一种HPLC法同时测定烤羊肉中5种硝基多环芳烃的方法，能够快速准确地测定5种强“三致”硝基多环芳烃的含量；姜三群[2]建立了HPLC-荧光检测器检测碳烤羊肉串中苯并芘的含量；王春蕾等[11]运用HPLC-紫外/荧光检测方法，能够准确检测熏肉制品中15种PAHs；而我国GB 5009.265—2016《食品中多环芳烃的测定》中规定了用液相色谱法测定食品中15种PAHs，并没有涉及对苊烯的检测[5]。

综上，关于烤羊肉串中16种PAHs的检测方法国内外研究报道较少，该试验用HPLC-荧光检测器串联二级阵列管检测器，通过系统优化前处理条件，建立16种PAHs的检测方法，以便为羊肉串中PAHs控制研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 Infinity Ⅱ HPLC(配有二极管阵列检测器和荧光检测器)，Agilent SB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、EV C18(50 mm×2.1 mm，4 μm)、symmetry R C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，美国Agilent公司；FSH-2A型可调高速匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；RE52CS旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；N-20多功能氮吹仪，长春乐镤科技有限公司；KQ-500E型超声波清洗器(500 W，40 kHz)，昆山市超声仪器有限公司；HX202T型电子天平，慈溪市天东衡器厂；TGL-16MC型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪集团；FCR1000-UF-E超纯水机，上海和泰仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

PAHs储备液的配制：用乙腈分别将16种PAHs标准品溶解于50 mL棕色容量瓶，配成不同浓度的标准储备溶液。

单标溶液的配制：移取适量的PAHs储备液，配制成16种50 ng/mL的等质量浓度单标溶液；

PAHs混标溶液的配制：移取适量PAHs储备液，配制成4 000 ng/mL的等质量浓度PAHs中间液，准确移取16种PAHs储备液各0.1 mL，配制成100 ng/mL的混标溶液，用乙腈稀释成质量浓度分别为1、5、10、20、50 ng/mL的混标溶液。所有标准溶液置于-18 ℃环境中储藏。

1.3.2 样品前处理条件优化

1.3.2.1 超声波辅助萃取时间的选择

称取市售碳烤羊肉串3 g(精确到0.001 g)，匀浆样品置于50 mL离心管中，再加入1 mL 30 μg/mL PAHs混标溶液，提取溶剂为20 mL 乙腈和 10 mL乙腈饱和正己烷，设置固相萃取柱为Florisil，洗脱剂为二氯甲烷，洗脱剂体积为11 mL，考察超声波辅助时间(10、20、30、40、50 min)对PAHs回收率的影响，筛选出最佳时间。

1.3.2.2 固相萃取柱的选择

样品预处理同上，设置超声萃取时间为30 min，洗脱剂为二氯甲烷，洗脱剂体积为11 mL，考察固相萃取柱(Florisil、PAH-MIP、C18、PCX)对PAHs回收率的影响，筛选出最佳固相萃取柱。

1.3.2.3 洗脱剂种类的选择

样品预处理同上，设置超声波萃取时间为30 min，固相萃取柱为PAH-MIP，洗脱剂为11 mL，考察洗脱剂[正己烷-二氯甲烷(30∶70，体积比，下同)、环己烷、二氯甲烷、正己烷-二氯甲烷(50∶50)、乙酸乙酯]对PAHs回收率的影响，筛选出最佳洗脱剂。

1.3.2.4 洗脱剂体积的选择

样品预处理同上，设置超声波萃取时间为30 min，固相萃取柱为PAH-MIP，洗脱剂为正己烷-二氯甲烷(30∶70)，考察洗脱剂体积(5、7、9、11、13 mL)对PAHs回收率的影响，筛选出最佳洗脱剂体积。

1.3.3 样品前处理

根据王冲[8]的方法稍作修改。提取：称取羊肉串肉样3 g(精确至0.001 g)，置于50 mL棕色离心管a中，加入10 mL乙腈饱和正己烷(乙腈饱和的正己烷溶液的配制：量取400 mL正己烷，加入100 mL乙腈，摇匀后静置，上层为乙腈饱和正己烷)和20 mL乙腈溶液匀浆，在40 ℃水浴下超声波辅助萃取30 min，在4 500 r/min冷冻(4 ℃)离心30 min，用移液枪将乙腈层移取到50 mL棕色离心管b中，将20 mL乙腈加入棕色离心管a中复提一次，吸取乙腈提取液合并到棕色离心管b中，用100 mL梨形烧瓶将棕色离心管b中的提取液在35 ℃下旋转蒸发至近干，加入6 mL正己烷复溶，涡旋振荡溶解。

净化：先用5 mL二氯甲烷活化PAH-MIP，再用10 mL正己烷平衡PAH-MIP，将6 mL正己烷提取样液转移到PAH-MIP中，用6 mL正己烷洗涤离心管b，并将洗涤液注入萃取柱中，用9 mL正己烷-二氯甲烷(30∶70)洗脱萃取柱，在10 mL试管c中收集所有洗脱液，氮吹(30 ℃)至有机溶剂全部挥发，加入1 mL乙腈涡旋振荡，用0.22 μm油系滤膜过滤，制得上机待测液。

1.3.4 仪器分析条件

色谱柱：Agilent SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈和水；进样量5 μL，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，根据出峰种类和峰的分离度优化梯度洗脱程序。检测器：荧光检测器和二级阵列管检测器串联。

1.3.5 方法的线性范围、检出限和定量限测定

在最优的测定方法下，对1.3.1配制的5种混标溶液(1、5、10、20、50 ng/mL)进行测定，横坐标为各混标的质量浓度，纵坐标为PAHs的峰面积，绘制标准曲线；检出限用3倍信噪比(S/N=3)确定，定量限用10倍信噪比(S/N=10)确定。

1.3.6 回收率和精密度测定

称取3 g市售羊肉串肉样，分别添加2、5、20 ng/mL混标溶液，按照1.3.3进行样品前处理，再进行上机分析，每个添加水平重复测定6次，计算肉样中回收率及精密度，即相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.3.7 实际肉样检测方法

3种不同来源的市售烤羊肉串(每种来源的羊肉串各做3个平行肉样)，用1.3.3前处理方法进行提取和纯化，用HPLC检测。

1.3.8 数据处理

采用HPLC自带的软件对峰面积进行积分处理。用SPSS 20.0对数据进行显著性分析(P<0.05)，用Origin 2017作图，每组试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

反相色谱柱是HPLC分析中最常用的柱子，该试验选取了Agilent SB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、EV C18(50 mm×2.1 mm，4 μm)、symmetry R C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，对比4种不同规格色谱柱对16种PAHs分离效果和出峰情况，结果显示，EV C18、symmetry R C18和AQ C18色谱柱响应值低、出峰种类少和峰形分离不彻底，Agilent SB C18柱具有良好的分离效果，可供检测16种PAHs。

2.2 梯度洗脱条件和检测波长的选择

水和乙腈的不同比例直接影响PAHs的分离度和出峰时间。该试验中，Ch和BaA、F和Ac、BbF和BkF分离度不高，经过优化，在5～25 min时，水相在27%～25%时，Ch和BaA及其他分离度不高的PAHs能够较好的分离，具体洗脱程序见表1。Ace无荧光性，用二极管阵列检测器在 230 nm 处测定Ace，其他15种PAHs荧光检测波长见表2。在该梯度洗脱程序下，16种PAHs能够较好分离。

表1 HPLC 流动相洗脱梯度Table 1 HPLC mobile phase elution gradient

表2 HPLC 荧光检测梯度Table 2 HPLC fluorescence detection gradient

2.3 超声波辅助萃取时间的选择

超声波时间对PAHs的提取也有着至关重要的影响，时间过短，导致萃取不完全，从而影响样品检测；时间过长，容易使低分子质量(2～3个苯环)的PAHs组分挥发而损失[12-13]。如图1所示，超声时间为10 min和20 min时，回收率略低于30 min，其原因可能是超声波时间较短，肉中PAHs未完全被提取出来；超声波时间为40 min和50 min时，回收率为56.96%～67.86%和52.26%～63.74%，显著低于30 min时的回收率，其原因可能是超声波时间过长，低分子质量的PAHs挥发损失，造成回收率低；超声波时间在30 min时，PAHs回收率最高，为63.65%～74.49%，因此选30 min作为前处理超声波萃取时间。

图1 不同超声波时间对PAHs回收率的影响Fig.1 Effect of different ultrasonic time on the recovery rate of PAHs注：不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)(下同)

2.4 固相萃取柱的选择

固相萃取柱可以达到净化和富集的双重功效，固相萃取柱填料种类不同，对PAHs有不同的吸附效果[14]。由图2可知，Florisil萃取柱回收率为62.5%～73.4%，显著低于PAH-MIP；PCX萃取柱和C18萃取柱对出峰前期低分子质量的PAHs有较高的回收率，但对Ch等高分子质量(4～6个苯环)PAHs回收率较低，其原因可能是萃取柱填充物质对高分子质量的PAHs吸附能力不强；PAH-MIP萃取柱回收率显著高于其他固相萃取柱，回收率为77.9%～91.9%，能够对PAHs特异性吸附，因此选择PAH-MIP萃取柱为前处理固相萃取柱。

图2 不同固相萃取柱对PAHs回收率的影响Fig.2 Effects of different solid phase extraction columns on the recovery of PAHs

2.5 洗脱剂种类的选择

PAHs属于非极性或极性较弱的碳氢化合物，洗脱剂的种类对PAHs的回收率有显著的影响[11]，目前PAH-MIP萃取柱多用二氯甲烷作为洗脱剂，二氯甲烷单独洗脱时，能够显著阻止脂肪进入待测样品中，但二氯甲烷对PAHs的洗脱效率较低[5,14-15]。如图3所示，乙酸乙酯和环己烷洗脱效果显著低于正己烷-二氯甲烷(30∶70，体积比，下同)；二氯甲烷单独洗脱时，回收率为77.94%～91.71%，但PAHs回收率显著低于正己烷-二氯甲烷(30∶70)；正己烷-二氯甲烷(50∶50)对低分子质量的PAHs回收率较高，但对大部分高分子质量的PAHs回收率较低，且整体PAHs回收率显著低于正己烷-二氯甲烷(30∶70)；洗脱剂为正己烷-二氯甲烷(30∶70)时，PAHs回收率最高，回收率为84.97%～103.82%，能够很好地从PAH-MIP萃取柱中将PAHs洗脱下来，因此选择正己烷-二氯甲烷(30∶70)为PAH-MIP的洗脱剂。

图3 不同洗脱剂种类对PAHs回收率的影响Fig.3 Effects of different eluents on the recovery of PAHs

2.6 洗脱剂体积的选择

固相萃取过程中，洗脱剂的体积往往直接影响目标化合物的洗脱效果，洗脱剂体积少容易造成洗脱不彻底，降低PAHs的回收率，但体积过高也会导致稀释效应，浓缩时也容易贴壁浪费，导致回收率降低[17]。如图4所示，当洗脱剂正己烷-二氯甲烷(30∶70)体积为5 mL和7 mL时，PAHs回收率显著低于9 mL时，其原因可能是洗脱体积少而造成洗脱不彻底，从而使PAHs回收率低；洗脱剂体积为11 mL时，回收率略低于9 mL，其原因可能由于稀释效应不明显；当洗脱剂体积为13 mL时，回收率显著低于9 mL，稀释效应明显。洗脱剂体积为9 mL时，PAHs回收率高于其他各体积，回收率为85.21%～105.74%，因此选9 mL正己烷-二氯甲烷(30∶70)为最优洗脱体积。