面向骨科植入物的仿生多孔结构设计与制造方法

焦 晨 晁 龙 朱 磊 沈理达 梁绘昕 戴 宁 王长江 孙 骏

1.南京航空航天大学机电学院，南京，210016

2.南京大学医学院附属鼓楼医院，南京，210008

3.萨塞克斯大学，布莱顿，英国，BN1 9RH

4.江苏省药品不良反应监测中心，南京，210002

0 引言

目前，骨缺损、粉碎性骨折等骨科疾病是骨科领域治疗研究的一个重点与难点，而采用外部植入体代替宿主骨是应对大面积骨缺损的有效途径。以往的致密植入体由于弹性模量过高而存在“应力屏蔽”问题[1-2]，即应力不能从植入体充分转移到骨，使植入体周围骨细胞难以得到足够的应力刺激而死亡。为解决传统致密植入体弹性模量过大带来的问题，人们将多孔结构引入到植入体[3-4]，通过调整孔隙率等参数，将支架弹性模量降低至人体骨骼水平，实现植入体与人体骨的匹配。使用多孔结构骨支架时，支架与人体骨组织的接触面积更大，能更好地引导骨细胞长入，在生物层面上实现固定结合[5]。目前，具有多孔结构的植入体可采用增材制造技术生产，其中，激光选区熔化[6-7](selective laser melting，SLM)和光固化成形[8-9](stereo lithography apparatus，SLA)是组织工程领域最常见的方法。采用增材制造技术制备的多孔支架具有强度高、质量小、耐腐蚀性好、弹性模量适中、生物相容性好等优点，在组织工程领域具有良好的应用前景[10-14]。

仿天然骨结构的设计方法正逐渐成为研究热点，研究者从形态、特征参数、力学性能和生物性能等多个方面综合评估骨支架的设计方案。目前，仿人体骨骼的设计主要通过基于图像的反求建模方法、数学建模方法等[15-19]。基于Voronoi细分的数学建模方法在构造多孔过程中表现出良好的性能，可构造出天然不规则多孔材料的近似模型，如胶原蛋白网络[20]和生物细胞结构[21-22]，因此受到了广泛关注。FANTINI等[23]提出了基于Voronoi方法的类骨小梁结构全互连多孔支架设计方法，GOMEZ等[24]结合显微CT对Voronoi骨小梁结构进行更精确的匹配。遗憾的是，以往对不规则多孔结构的多数研究忽略了不规则度及其演化的影响，造成结构力学性能的不稳定。

笔者使用一种正向设计方法，基于泰森多边形原理构建可控多孔支架，并将其与规则排列多孔结构进行比对。为评估多孔支架形态等设计参数的影响，采用激光选区熔化工艺与数字光处理(digital light processing，DLP)技术制备了金属与陶瓷样品，从仿生性能、压缩性能等多个维度进行评价，为设计、制造与潜在应用提供数据支撑。

1 试验方法

1.1 多孔结构的设计方法

基于泰森多边形的不规则多孔结构设计方法是通过概率球控制点阵的不规则多孔结构设计方法，其基本设计思路是：在空间规则排列的球形区域内随机生成种子点，利用泰森多边形原理对随机种子点阵进行联结并生成Voronoi元胞，基于所生成元胞进行优化并形成多孔支架。本文采用犀牛grasshopper进行模型构建，通过赋予元胞各棱的直径来改变孔隙率。试验中，设置3个水平的孔隙率、3个水平的不规则度，通过试验获取各参数支架的弹性模量、压缩强度等参数，从而筛选具有最优综合性能的设计参数。本文不规则结构的设计方法如图1所示。

随机多孔结构与规则多孔结构的打印尺寸均为16 mm×16 mm×12 mm，规则结构的内部由4 mm×4 mm×4 mm的单元体进行结构填充，单元体结构分别为金刚石结构、菱形十二面体结构、面心结构、体心结构，如图1所示。

图1 多孔结构的构建方法

1.2 多孔结构的制备

多孔结构成形原理及样件如图2所示。使用SLM设备(EOSINT M290；EOS GmbH，德国)和优化的工艺参数制造试样，所使用材料为Ti-6Al-4V粉末，具体工艺参数为：功率180 W，扫描速度1 m/s，扫描间距0.06 mm，层厚30 μm。第1组试样的不规则度(随机点生成区域直径与原始点间距的比值)ε为0.10、0.25、0.50，设计孔隙率Φ为(60±1)%，控制点数为2000；第2组试样的ε为0.5，Φ分别为(50±1)%、(60±1)%、(70±1)%，控制点数为1000，所成形样件如图2b所示。

使用自研DLP设备成形陶瓷多孔结构，所用材料为ZrO2/HA复合陶瓷粉末，具体的参数如下：氧化锆的质量分数为75%，分散剂的质量分数为2%，曝光层厚20 μm，曝光时长10 s，曝光功率20 mW/cm2，以“先真空、后空气”的脱脂氛围对坯体进行脱脂[25]。采用无压方式烧结图2d所示样件，烧结后的样件会收缩变致密。

(a)SLM成形原理 (b)金属支架样件

1.3 设计模型的有限元分析

使用商业软件ABAQUS 2016对理想的设计多孔结构进行了有限元分析，确定结构参数对力学性能的影响，仿真的材料为钛合金，其弹性模量为105 GPa，泊松比为0.3，屈服强度为830 MPa。假设有限元模型是线性、弹性和均匀的，在底部边界固定的情况下，对支架的顶部施加100 MPa的压力。通过参数设置、模型网格划分和求解，研究压力作用下多孔支架的应力分布。

1.4 生物相容性检测

使用小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1进行体外细胞培养，将分散在60 μL悬浮液中约20 000个细胞滴种在支架表面，随后在37 ℃下静态培养4 h以促进细胞附着。以添加10%(体积分数)胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的细胞培养基DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)为培养基。将细胞种植的支架转移到24孔板上，4 h后添加培养基进行后续培养，随后每2天更新一次培养基。

使用荧光染色法检测细胞活力，培养1天后，支架吸收细胞并用磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，PBS)洗涤，然后用5 mol/L钙黄绿素和4 mol/L同二聚体乙醚处理细胞20 min，清洗后将其安装在载玻片上进行荧光显微镜观察。

采用扫描电镜观察细胞在支架上的附着情况，在细胞接种支架培养3天后，用PBS冲洗，用体积分数2.5%的戊二醛溶液浸泡2 h以固定细胞，在梯度乙醇/蒸馏水混合物中脱水10 min并在六甲基二硅氮烷中干燥，最后在扫描电镜下观察支架上附着的细胞。

采用CCK-8法检测细胞增殖，在培养1、3和5 天时，在24孔板各孔位滴入10 μL CCK-8，随后在37 ℃继续培养2 h，最后通过范式检测平台在450 nm处测量吸光度(重复实验次数n=3)。

2 性能评价

2.1 随机多孔结构参数的影响

图3所示为不同金属支架的静态压缩试验结果。将弹性模量和极限强度作为评价多孔生物材料力学性能的关键表征参数。如图3c所示，设计孔隙率为(60±1)%时，样品的弹性模量为3.16～3.80 GPa，且随着不规则度的增大，弹性模量逐渐减小；样品的极限强度为106～158 MPa，且随不规则度增大呈现先降后升的趋势。如图3d所示，不规则度为0.5时，不同孔隙率样品的弹性模量为1.84～5.11 GPa，极限强度为44.0～234.5 MPa。压缩测试结果表明孔隙率较大的多孔结构具有较小的弹性模量和极限强度，测试范围内的弹性模量、极限强度均与孔隙率成线性关系。该现象在关于晶格结构的相关研究中已得到证实[26]，因此在一定范围内通过微调孔隙率使多孔结构达到所需的压缩强度。由图3e可以看到，多孔结构在压缩时有明显的弹性压缩阶段，此阶段对应的压缩应力为该支架的可承受载荷。载荷继续增大，结构逐渐溃缩，局部应力超过极限载荷，部分梁结构断裂，造成结构失效。

(a)不同不规则度支架压缩曲线 (b)不同孔隙率支架压缩曲线

为验证不规则度对压缩性能的影响，通过仿真软件对金属支架进行模拟，仿真结果与上述实验结果变化趋势相同。图4所示为不同不规则度的结构承受相同载荷时的应力分布，高应力区集中在不规则梁的交界处，不规则度为0.25的多孔样件具有最高的局部应力2146 MPa，因此可以推测具有较差的抗压性能。不规则度增大时，多孔结构的部分单位晶胞逐渐从规则结构畸变为不规则结构，导致不规则梁的尺寸发生急剧变化，力学性能下降；不规则度达到较高水平时，不规则多孔结构在高应力区形成更为平滑的过渡来改善压缩性能。

(a)ε=0.1 (b)ε=0.25 (c)ε=0.5

2.2 结构、材料与压缩性能

图3验证了基于泰森多边形的随机多孔结构具有类似的压缩曲线。孔隙率、不规则度对极限压缩强度等力学性能具有决定性的影响，本部分将ε=0.5、Φ=60%的随机多孔结构与图1所示的4类规则多孔结构进行比对。为研究不同材料的同类型结构压缩性能的差别，笔者采用DLP工艺制备了与金属支架结构相同的陶瓷支架。考虑到陶瓷结构在烧结后收缩，因此以烧结后的陶瓷结构尺寸作为设计参数制备SLM成形金属结构。

5类金属结构与5类陶瓷结构的压缩应力-应变曲线如图5所示，从总体上看，不规则多孔结构、菱形十二面体结构、金刚石结构具有相近的压缩性能，其原因在于这3种结构具有不同方向的承载梁，压应力在整个结构内部的分布较为均匀。与菱形十二面体、金刚石结构相比，不规则多孔结构还有可调参数——不规则度，因此在调控力学性能方面具有显著优势。同时，随机多孔结构内部梁的分布更随机，各项力学性能与受力方向关联性低，因而不会因为特定方向承受载荷而溃缩。体心结构与面心结构仅在特定方向具有优良的力学性能，承受不沿特定方向施加的载荷时容易出现结构滑移，从而失效，其承载能力仅为不规则、菱形十二面体及金刚石结构的20%，因此在设计过程中，尽量排除体心结构与面心结构。

(b)陶瓷材料

陶瓷结构与金属结构在承受载荷方面存在显著差别。由图5b可知，陶瓷结构承受一定载荷后，出现了一段缓慢上升的准平台期，其原因在于氧化锆在受力时从四方相转变为单斜相，通过相变吸收部分载荷的能量[27-28]，使结构不溃缩。载荷超过一定值后，由于陶瓷材料自身的脆性，结构产生局部脆性断裂，从而失效，在图形上显示出更大的波动。由5b所示的测试结果可知，不规则多孔结构、体心结构、菱形十二面体结构可承受的极限压力为7～15 MPa，而人体松质骨的抗压强度为2～20 MPa[29]，因此植入时，陶瓷材料可作为松质骨的替换材料，而金属结构具有更好的力学性能，可用于替换皮质骨[30]。将本文所成形支架与类似研究中支架的弹性模量、极限强度等进行比对，结果如图6所示，弹性模量与极限强度成准线性关系，并且不同材料对应的坐标区域有显著差异。

图6 支架力学性能比对

2.3 支架生物相容性

使用光学显微镜观测一定时间培养后的细胞。如图7a所示，长条状的是正常生长的细胞，白点亮点是死亡细胞或细胞代谢物，观测范围内的细胞增殖分化状态良好。在支架上接种细胞，培养3天后的结果如图7b所示，细胞已在图中以黄色虚线进行了标记，可见，培养3天后的细胞能附着在支架表面，且细胞相互聚集，成片分布于测试件表面凸起或凹陷处，细胞足端有明显的伪足伸出并与测试件表面联结，说明多孔支架能为细胞提供良好的生长环境，为后期细胞增殖、分化等提供有利条件。

(a)培养基内 (b)支架上

将变不规则度的金属支架与陶瓷材料支架进行比对，采用CCK-8法测定经一定时间培养后细胞的有效增殖。定量测试结果如图8a所示，细胞数量随培养天数增加而不断增长，进一步表明各类支架均具有良好的生物相容性。不规则度较小时，支架内较为单一的孔隙组合以及较小的附着面积导致培养后的细胞增殖数小于对照组；不规则度升大时，不规则多孔结构内形状多样的大小孔形成了良好组合，为细胞附着与增殖提供了有利条件，因而在光密度(optical density，OD)上大于对照组。图8b所示的染色结果表明，不规则度增大时，细胞增殖更为明显，伪足清晰可见(表明细胞有效附着在支架上)。与金属支架相比，陶瓷支架的羟基磷灰石使其在细胞增殖方面具有更优良的性能。

(a)CCK8测定结果

2.4 应用展望

基于Voronoi细分的方法可以有效模拟健康海绵骨的结构，并具有较高的精度。大多数情况下，通过调整种子点分布和缩放系数，可制备孔隙率在50%～80%的多孔结构，成形的结构与自然小梁骨如图9所示[31]。随机的种子提供了几何上的异质性，产生了真正的仿生形状，根据力学性能与生物相容性的比对结果可知，不规则度为0.5的结构是最优的类小梁结构，在此基础上改变控制点密度可以制备具有梯度孔隙率的仿生结构来匹配具有不同孔隙率的小梁结构。

(a)健康海绵状骨 (b)均质仿生多孔结构

将此方法推广，通过对部分结构进行多孔化及布尔运算，设计具有部分疏松多孔的复杂结构植入假体。图10展示了髋臼杯多孔结构的设计流程，该结构的内表面保持相对光滑，从而减少关节运动带来的磨损，外表面的疏松多孔结构可以诱导骨细胞长入与分化，获得优良的生物固定性能。

图10 髋臼杯多孔表层结构设计

3 结论

本文基于泰森多边形原理构建了4类具有规则多孔特征的支架，从材料及结构方面比对SLM制备的金属支架与DLP制备的陶瓷支架的静态力学性能和生物相容性。研究结果表明，随机多孔结构的不规则度与孔隙率均对压缩性能有影响，可以通过调节二者来调控力学性能；孔隙率近似的情况下，不规则多孔支架与菱形十二面体及金刚石结构具有相似的力学性能，金属支架适合皮质骨的替换而陶瓷支架适合松质骨的替换。同时，随机多孔支架的大小孔隙组合能促进细胞的附着与分化。综上，采用Voronoi原理设计的仿生结构具有良好的力学性能及细胞相容性，可匹配人体不同部位的骨骼，是一种潜在的植入结构。