干旱和盐胁迫下百子莲的抗逆生理研究

刘 涛，陈海荣，汪成忠，任 丽，*，张 荻，*

(1.上海交通大学 设计学院 风景园林系，上海 200240；2.上海市农业科学院 农产品质量标准与检测技术研究所，上海201403；3.苏州农业职业技术学院，江苏 苏州 215008)

干旱胁迫和盐胁迫是植物遭受的两种主要的非生物胁迫，能导致植物体内失水，引起叶绿素(chlorophyll，Chl)降解，影响植物的光合作用和生理代谢过程，积累活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)，损伤细胞膜系统，造成氧化胁迫伤害[1]。植物通过体内的信号传导途径传递胁迫信号，调控超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)等抗氧化酶组成的酶促抗氧化系统，清除胞内过量的ROS组分，并积累脯氨酸(proline，Pro)、总可溶性蛋白(total soluble protein，TSP)等渗透调节物质，保护细胞结构的完整性，从而减轻氧化胁迫伤害，提高自身的耐旱和耐盐能力[2-3]。

随着城市工业化的发展和自然环境的日益恶化，土壤干旱、盐碱化等城市环境问题日益凸显，对园林景观中观赏植物的抗逆保护与生态修复能力提出了更高的要求。因此，挖掘观赏性与抗逆性能优良的植物资源，对丰富城市生物多样性与景观多样性具有重要的意义。有研究通过外源施加低浓度硝普钠提高菊花神马品种(Chrysanthemummorifoliumcv.Jinba)的耐盐性，为菊花在盐渍化土壤中的应用提供参考依据[4]。邓丽娟等[5]研究多种观赏海棠品种对干旱胁迫的响应，以综合评价其抗逆性并筛选适宜景观种植的品种。

百子莲(AgapanthuspraecoxL.)，又称非洲百合、蓝百合，是百子莲科(Agapanthaceae)百子莲属(Agapanthus)的多年生根茎类花卉。蓝色大花百子莲(A.praecoxssp.orientalisBig Blue)于2006年作为一种新优花卉引入我国，是夏季不可多得的蓝紫色观赏花卉。近年来对其花芽分化机理、开花调控、组培快繁与种质资源保存等方面的研究已有较大突破[6-8]，在以上繁育、栽培技术的支撑下，目前，蓝色大花百子莲已成为我国城市园林绿化应用的主栽品种，具备观赏价值高、生态适应性强的特点[9-10]，但在抗旱、抗盐能力等方面还缺乏科学、系统的评价。在城市有限的自然生态环境下，如何科学、合理地应用仍缺少方法与理论支撑。因此，本研究选取蓝色大花百子莲实生苗为材料，从抗逆生理和氧化应激相关基因表达层面评价该品种对干旱和盐胁迫环境的耐受能力，为指导其在干旱和盐胁迫逆境下的园林应用、生态修复与景观营造等提供科学依据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蓝色大花百子莲幼苗购自上房园艺公司，种植于上海交通大学试验田。本实验选取株高20～25 cm、株径1～2 cm、长势良好的百子莲2年实生苗，由试验田移栽入花盆，放置于25 ℃/20 ℃(昼/夜)，14 h光周期(光强12 klx)，70%相对湿度的光照培养箱中适应性培养7 d，在春季百子莲处于营养生长阶段进行实验处理。

1.2 胁迫处理方法

干旱胁迫处理：对上述培养箱中园土培养的百子莲充分浇水，而后进行断水处理，保持室外空气湿度，设置4～6个重复，园土为壤土，土壤pH值6.0～6.5。基于胁迫表型，于处理0、30、50、70 d时测定土壤含水量，并取外部3～4轮叶片先端测定生理指标；基于对百子莲响应逆境信号的应答模式研究[11]，在处理0、4、8、12 d时取相同部位叶片用于基因表达定量检测。

半致死NaCl浓度测定：将百子莲从园土中取出后清除土壤，为便于控制处理浓度，将其水培于含1/2 Hoagland的水溶液中并持续供氧，适应性培养7 d。以1/2 Hoagland水溶液培养作为对照组，NaCl处理浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，每个处理3个重复，测定处理5、10 d时的叶片相对电导率，拟合Logistic方程计算半致死NaCl浓度。

盐胁迫处理：将适应性水培7 d后的百子莲置于半致死NaCl浓度的1/2 Hoagland水溶液中并持续供氧，设置4～6个重复。基于胁迫表型及相对电导率-处理时间曲线，计算得拐点与平台期分别约为4、12 d，于处理0、4、8、12 d时取外部3～4轮叶片先端测定生理指标；基于对百子莲响应逆境信号的应答模式研究[11]，在处理0、12、24、48、96 h时取相同部位叶片用于基因表达定量检测。

1.3 实验方法

1.3.1 生理生化指标定量检测

观测两种胁迫下百子莲的胁迫表型并测定植株鲜重(fresh weight)，改进张志良等[12]的方法测定百子莲的叶片相对电导率(relative electrolyte leakage，REL)。取0.1 g叶片鲜样，剪成约0.5 cm×0.5 cm的小块，去离子水洗涤2～3次后浸没在10 mL去离子水中，置于25 ℃、120 r·min-1恒温摇床中振荡8 h后测定电导率R1；沸水浴处理30 min后冷却至室温，测定电导率R2；测定去离子水的电导率R0；测定3个生物学重复。相对电导率REL(%)=(R1-R0)/(R2-R0)×100。

叶绿素含量参照张志良等[12]的方法测定，总可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛含量及超氧化物歧化酶、过氧化酶活性参考Yang等[13]的方法利用南京建成试剂盒参照说明书测定，过氧化氢酶活性参考Ren等[14]的方法利用碧云天检测试剂盒参照说明书测定。

1.3.2 基因表达定量分析

基于Zhang等[15]利用转录组学在百子莲胚性愈伤组织超低温保存过程中筛选出的具有重要保护功能的氧化应激相关基因，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行基因表达定量分析。利用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(Takara)RNA试剂盒提取叶片RNA，采用TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒反转录得到cDNA。利用Primer Premier 5软件进行引物设计。以百子莲Actin基因(Ap-Actin)作为内参基因[11]，利用TB Green Premix EX TaqTMⅡ(TaKaRa)试剂盒于Applied Biosystem 7500 Real-Time PCR system(ABI，USA)进行基因定量检测，每个样品3次重复，采用2﹣△△CT法进行基因相对定量分析。所用引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR目的基因与引物序列

1.4 数据统计学分析

2 结果与分析

2.1 干旱和盐胁迫条件下百子莲生理生化指标的变化

2.1.1 逆境表型观测

图1 干旱(A)和盐浓度梯度(B)下百子莲的植株形态变化

不同小写字母表示在相同胁迫处理条件下不同胁迫时间内土壤含水量或百子莲全株鲜重存在显著性差异，P<0.05。

2.1.2 叶片相对电导率(REL)

干旱胁迫和盐胁迫下，百子莲叶片相对电导率均随胁迫时间增加而持续上升(图3-A、I)。干旱胁迫0～50 d叶片相对电导率缓慢上升，由9.51%上升至15.12%，至70 d时快速升高至24.47%，为0 d的2.57倍。盐胁迫4 d时叶片相对电导率快速上升，由0 d的5.69%上升到14.44%，而后无显著变化，至12 d时又快速上升至21.91%，为0 d的3.85倍。

2.1.3 总可溶性蛋白含量(TSP)

两种胁迫下，总可溶性蛋白含量随胁迫时间增长而逐渐积累(图3-B、J)。干旱胁迫至70 d时含量由0 d的0.89 mg·g-1显著上升至1.48 mg·g-1，上升66.3%。盐胁迫至12 d时含量由0 d的0.98 mg·g-1显著上升至1.72 mg·g-1，上升75.5%。

2.1.4 叶绿素含量(Chl)

两种胁迫下，叶绿素含量呈现差异变化(图3-C、K)。干旱胁迫0～50 d时叶绿素含量显著上升，由0.85 mg·mg-1升至1.33 mg·mg-1，上升56.5%，而后显著下降。盐胁迫0～12 d叶绿素含量逐渐下降但差异不显著，由0.81 mg·mg-1下降至0.68 mg·mg-1，下降16.0%。

2.1.5 脯氨酸含量(Pro)

如图3-D、L，干旱胁迫下，百子莲叶片中脯氨酸含量呈波动变化，先上升后下降再上升，70 d时较0 d时上升24.0%但均无显著变化。盐胁迫下，脯氨酸含量于0 d至8 d显著下降，由24.48 μg·mg-1显著下降至9.52 μg·mg-1，下降61.1%，而后至12 d时小幅上升但无显著差异。

2.1.6 丙二醛含量(MDA)

两种胁迫下，丙二醛含量于初期无显著变化，后随胁迫时间的增长而显著上升，膜脂过氧化程度加剧(图3-E、M)。干旱胁迫0～70 d时MDA含量由5.18 nmol·mg-1显著上升至11.44 nmol·mg-1，上升120.8%。盐胁迫0～12 d时MDA含量由4.30 nmol·mg-1显著上升至7.21 nmol·mg-1，上升67.7%。

2.1.7 抗氧化酶活性

干旱胁迫下，SOD、POD活性均呈现出先上升后下降的趋势，分别由0 d的90.29 U·mg-1、31.26 U·mg-1显著上升至30 d的119.85 U·mg-1、37.98 U·mg-1并达到峰值，上升32.7%、21.5%，随后显著下降；CAT活性持续显著下降，活性由0 d的75.65 U·mg-1显著下降至70 d的26.88 U·mg-1，下降64.5%(图3-F-H)。盐胁迫下，SOD、POD、CAT的活性分别由0 d的128.84 U·mg-1、41.36 U·mg-1、86.51 U·mg-1下降至12 d的72.68 U·mg-1、19.68 U·mg-1、51.79 U·mg-1，分别显著下降43.6%、52.4%、40.1%(图3-N-P)。

总可溶性蛋白含量单位标准化为每克植物干重，其余生理指标(除相对电导率外)单位标准化为每毫克蛋白。不同小写字母表示在相同胁迫处理条件下不同胁迫时间内百子莲的抗性生理指标存在显著性差异，P<0.05。

2.2 干旱和盐胁迫下百子莲抗性生理指标相关性分析

干旱胁迫下百子莲抗性生理指标的相关性分析结果显示(表2)，叶片相对电导率与脯氨酸含量呈显著正相关，相关系数为0.885，表明百子莲在干旱胁迫下通过调节脯氨酸含量从而产生一定的质膜保护功能。POD活性与MDA含量显著负相关，与SOD活性显著正相关，相关系数分别为-0.894、0.891，表明POD与SOD可能在清除活性氧分子、降低氧化胁迫伤害方面存在协同作用，以缓解细胞膜脂过氧化程度，从而提高百子莲对干旱胁迫的耐受能力。

表2 干旱胁迫下百子莲抗性生理指标相关性分析

盐胁迫下百子莲抗性生理指标的相关性分析结果显示(表3)，百子莲MDA含量与总可溶性蛋白含量显著负相关，相关系数为-0.964，表明可溶性蛋白可能参与到了盐胁迫下膜脂保护的过程中。SOD活性与叶绿素含量极显著负相关，与POD活性显著正相关，相关系数分别为-0.993、0.986，且脯氨酸含量与SOD活性显著正相关、与POD活性极显著正相关，相关系数分别为0.982、0.996，表明SOD与POD在盐胁迫中也可能存在协同作用，脯氨酸在盐胁迫下对细胞具有积极的渗透调节作用。CAT活性与叶片相对电导率显著负相关，相关系数为-0.976，表明CAT与胁迫下通过清除H2O2从而保护细胞膜稳定性有关。

表3 盐胁迫下百子莲抗性生理指标相关性分析

2.3 干旱和盐胁迫对百子莲抗氧化酶基因表达量的影响

干旱胁迫下(图4-A-F)，Cu/Zn-SOD、POD在胁迫12 d时显著上调表达，表达量为0 d时的1.7、20.7倍；Fe-SOD先小幅波动，无显著性差异，于12 d时显著下调表达，CAT持续显著下调；APX、GPX表达量先上升后下降，分别在8 d、4 d时达到峰值，分别为0 d时表达量的38.0与1.7倍。其中，POD、APX上调表达幅度最大，分别是0 d的20.8与38.2倍。盐胁迫下(图4-G-L)，Cu/Zn-SOD、POD表达量呈单峰曲线的变化趋势，于胁迫24 h时分别达到最高峰，为0 h时的3.6与4.8倍，CAT表达量于胁迫12 h后显著上调为0 h的1.3倍，随后显著下降；Fe-SOD、APX表达量均下降后小幅上升，但均低于胁迫0 h时；GPX表达量呈波动状，先下降后上升再下降。其中，Cu/Zn-SOD、POD上调表达幅度最大，分别是0 h的3.6、4.8倍，APX下调表达幅度最大，为0 h时的0.1倍。

不同小写字母表示百子莲在相同胁迫处理条件下不同时间内抗氧化酶基因相对表达量存在显著性差异，P<0.05。

2.4 干旱和盐胁迫下百子莲的抗逆性综合评价

对百子莲的8种抗性生理指标进行主成分分析(表4)，干旱胁迫和盐胁迫下分别得到3个和1个主成分，累积贡献率分别达到100%和85.872%，表明该主成分已基本包含8种抗性生理指标85%以上的信息。由表5可知，百子莲在干旱胁迫下可从膜脂过氧化程度(MDA)、抗氧化酶活性(SOD)和渗透调节物质含量(TSP、Pro)等指标反映其耐旱能力，在盐胁迫下抗氧化酶活性(SOD、POD)则作为反映耐盐能力的主要综合指标。

表4 干旱和盐胁迫下百子莲的抗逆生理指标主成分分析

3 讨论

蓝色大花百子莲作为近年来在城市园林绿化中广泛应用且观赏价值较高的一类夏季开花的观赏花卉，科学地评价其生态适应性对其在干旱、盐碱等逆境下的应用具有重要意义。研究表明，胁迫环境对植物的生长发育带来不良影响，植物细胞失水，胞内渗透压降低，体内碳同化减弱，PSⅡ活性下降，细胞膜被攻击，造成膜系统的损坏[17]，上述生理指标可作为逆境下评价植物受胁迫程度的重要依据[18]。

干旱和盐胁迫中，植物体内含水量降低，细胞感受胁迫信号后，胁迫响应基因被诱导表达，调控下游生理生化过程，通过积累渗透调节物质，包括脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等，增强自身应对恶劣环境的能力是植物抵抗外界胁迫的重要方式之一[19-20]。张治振等[21]发现多种幼苗期水稻(Oryzasativa)在盐胁迫处理下脯氨酸含量显著上升；李玉梅等[22]发现盐胁迫处理下牛叠肚(Rubuscrataegifolius)幼苗积累游离脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖等共同发挥渗透调节功能；祁伟亮等[23]发现不同桑品种在轻度干旱胁迫下脯氨酸积累量较多，重度干旱胁迫下积累较慢。本研究结果显示，两种胁迫下，百子莲的总可溶性蛋白含量均显著上升，干旱胁迫下脯氨酸含量先波动变化后小幅上升，而盐胁迫下脯氨酸含量显著下降后维持稳定，在两种胁迫下发挥的渗透保护机制可能有所差异。多数报道表明，植物在受到非生物逆境胁迫后叶绿素合成受到抑制，加速降解，导致叶绿素含量在胁迫时显著下降，影响植物的正常光合作用，且胁迫程度越严重，叶绿素含量下降越快[24-25]。本研究结果显示，百子莲叶绿素含量在干旱胁迫中先升后降，在盐胁迫中维持相对稳定。陈洪[26]发现木麻黄(Casuarinaequisetifolia)在轻度胁迫下叶绿素先升后降，重度胁迫下叶绿素含量下降。结合形态观测的结果推测，胁迫前期百子莲主要表现为植株被动失水，植株含水量快速下降，渗透势提高，叶绿素分解速度较慢，保持一定的光合能力，至胁迫中后期，叶绿素加速降解，含量下降明显。膜脂过氧化程度最终产物之一的MDA及相对电导率能直观反映植物细胞在胁迫环境中的受损程度，被广泛地用来评价膜损伤程度[27]。小麦(Triticumaestivum)[28]、多种含笑品种[29]、高羊茅(Festucaarundinacea)[30]等植物在非生物胁迫下相对电导率与MDA含量均显著上升，表明膜系统遭到破坏。本研究结果显示，百子莲在干旱和盐胁迫逆境中表现出胁迫初期MDA含量无明显变化，中后期含量显著上升，与相对电导率变化趋势相同，表明在胁迫初期百子莲的胁迫伤害较轻，能够维持细胞膜稳定性。而随着胁迫时间的延长，百子莲的胁迫伤害加重，表现为MDA含量及相对电导率显著上升。盐胁迫下MDA含量与可溶性蛋白含量存在显著负相关，表明胁迫下百子莲积累可溶性蛋白，细胞保护作用提升，膜脂过氧化可能得到缓解。综上所述，由渗透调节物质、叶绿素含量、MDA及相对电导率等均在胁迫初期相对稳定，中后期发生显著变化，表明百子莲在干旱和盐胁迫初期具有一定的耐受能力，但胁迫后期损伤加剧，超出其耐受范围。

为了应对胁迫对植物产生的胁迫伤害，植物经过长期的进化形成一套能够清除活性氧分子、维持动态平衡的抗氧化系统，以抵抗非生物胁迫对质膜造成的次级氧化伤害。其中，SOD、CAT、POD三种主要抗氧化酶起着较为关键的作用：SOD作为植物清除体内ROS的第一道防线，转化超氧阴离子为H2O2，其活性增强有利于提高植物的抗逆性，POD主要作用为降低H2O2含量，CAT主要清除光呼吸和脂肪酸β氧化过程中产生的H2O，维持植物体内的代谢平衡[31-33]。干旱胁迫下百子莲SOD、POD活性随胁迫时间增长先升后降，胁迫初期抗氧化能力较强，但至胁迫中后期活性显著降低，胁迫伤害加剧，这与裸果木(Gymnocarposprzewalskii)中龄叶片[34]、沙棘(Hippophaerhamnoides)[35]叶片及杨树(Populus×euramericanacv.Neva)[36]幼苗叶片等的发现一致。盐胁迫下3种主要抗氧化酶活性随胁迫时间增长而下降，对体内ROS的清除能力降低，与潘璐等[37]在盐胁迫下两种海棠的抗氧化酶活性先升后降的报道相悖，与Katuwal等[38]发现在盐胁迫下草坪草Seastar和UGP113的 POD、CAT活性显著降低，SOD活性显著升高的报道不符。研究发现，低盐浓度下非盐生植物的抗氧化酶活性随胁迫时间的增加而先升后降，但盐浓度若超过植物的耐受能力，则具有保护作用的抗氧化酶活性下降[39]。因此推测NaCl处理浓度可能过高，超出了植株的承受极限，对百子莲造成了严重的胁迫伤害，植株体内产生与清除活性氧的平衡已被打破，导致活性氧大量积累，细胞受损程度较重，抗氧化酶系统活性持续下降。而百子莲的抗氧化酶SOD、POD在两种胁迫下均显著正相关，胁迫初期均具有较高活性，且Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、POD基因于胁迫不同阶段均上调表达，表明干旱和盐胁迫均能影响百子莲体内的ROS信号转导与酶促抗氧化剂活性，内源抗氧化系统对提高百子莲抗逆性具有重要作用。

植物对逆境环境的生理调节和响应存在差异，机制不同，受到多种基因等的影响，无法利用某一特定指标或基因对植物抗逆能力做出较为准确的评价。主成分分析法突破某单一指标无法准确评价其抗逆性的局限性，综合考量各指标间的相关性[40-41]，此方法在植物抗逆性综合评价中得到了较为广泛的应用[42-44]。本研究采用主成分分析法对蓝色大花百子莲在干旱和盐胁迫下的抗性生理指标进行综合分析，认为可从膜脂过氧化(MDA)、抗氧化酶活性(SOD)及渗透调节物质含量(TSP、Pro)等层面评价其对干旱的耐受能力，以抗氧化酶活性(SOD、POD)来主要反映耐受百子莲高盐环境的能力。孙林等[45]对比华南地区的22种园林植物，发现15 d干旱胁迫后灰莉(Fagraeaceilanica)、桂花(Osmanthusfragransvar.fragrans)、鸢尾(Iristectorum)等强耐旱植物中MDA、电导率、抗氧化酶等评价抗旱性的指标变化较小，耐旱性较弱的植物变化显著；本研究中30 d干旱处理后蓝色大花百子莲的相关指标变化趋势与上述强耐旱植物一致，处理至50 d时百子莲植株仍存活，以上研究结果证明蓝色大花百子莲是一种耐旱性较强的园林观赏植物。此外，植物在盐胁迫下的抗逆能力也可以通过半致死NaCl浓度来反映：袁小环等[46]测得拟合度较高的6种观赏草幼苗的半致死盐浓度在0.36%～2.34%；谢委等[47]测得中牧一号紫花苜蓿(Medicagosativa.cv.Zhongmu No.1)的半致死盐浓度介于200～220 mmol·L-1；本研究测得蓝色大花百子莲的半致死盐浓度约为1.29%(约220.5 mmol·L-1)，根据Breckle对植物耐盐性划分的标准[48]，可将其划分为类盐生植物，表明其具有较强的耐盐能力。

本研究所采用的土壤、培养环境及处理方式可能与真实的自然环境有一定差别，因此后续可模拟真实自然的生长环境，评价复合胁迫环境下蓝色大花百子莲的抗逆性，为其在园林景观和生态修复中的应用提供更直接的理论指导和科学依据。

4 结论

蓝色大花百子莲具有较强的耐旱能力，园土培养下能够通过生理调节，提高渗透调节物质含量及抗氧化酶活性，完全耐受30 d左右的干旱胁迫；盐胁迫下的半致死NaCl浓度约为1.29%，此浓度下百子莲提高渗透保护作用维持细胞稳定性，应对盐胁迫伤害。园林应用中可从膜脂过氧化、抗氧化酶活性和渗透调节物质含量评价蓝色大花百子莲的耐旱能力，从抗氧化酶活性和半致死NaCl浓度来评价其耐盐能力。