嵌合抗原受体-T细胞免疫疗法在实体瘤中的进展及挑战

杨亚蓝，宗上纲，王莉，王峰

(1.郑州大学第一附属医院 肿瘤科，河南 郑州 450052； 2.河南省医学科学院，河南 郑州 450052)

免疫治疗新时代的到来，极大地改变了肿瘤治疗模式[1]。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞作为新兴的过继性免疫治疗策略，已成为近年来肿瘤治疗研究领域的热点和焦点[2-3]。血液中的T细胞经过分离活化、基因修饰和改造、体外扩增、体内回输等一系列过程，可识别特定肿瘤表面抗原并发挥靶细胞杀伤作用[3]。目前，CAR-T细胞治疗B细胞白血病或淋巴瘤亚群，总体缓解率高且作用持久，这给肿瘤免疫治疗带来革命性的改变[4-5]。同时，CAR-T细胞免疫疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中的成功为实体瘤的治愈提供了新的希望，一系列CAR-T细胞的早期临床试验在实体瘤中开展[6-9]。与血液系统疾病相比，选择适当的肿瘤特异性抗原、增加CAR-T细胞在肿瘤位点的归巢、中和免疫抑制微环境、克服CAR-T细胞毒性是阻碍实体瘤中CAR-T细胞发挥疗效的重要因素。本综述回顾了CAR-T 细胞的研究进展，指出了CAR-T细胞在实体瘤治疗中面临的挑战和新的策略，旨在为CAR-T细胞治疗实体瘤的临床前实验和临床试验提供新的思路。

1 CAR-T细胞的发展

CARs是基因工程受体，主要由细胞外抗原识别域(胞外域)、铰链区、跨膜结构域和细胞内信号转导域(内域)共4部分组成[10]。胞外抗原识别结构域主要为靶抗原-抗体的单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)，由重链可变区(heavy chain variable，VH)和轻链可变区(light chain variable，VL)组成，是CAR-T细胞特异性识别靶细胞的“定位器”，通过引起主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)非依赖性T细胞活化[11]，发挥特异性杀伤作用。铰链区和跨膜结构域是细胞外和细胞内结构域的“连接器”，有助于CARs表达和稳定性的增强、CARs和抗原的相互识别、CAR-T激活的刺激信号的募集及免疫突触形成。铰链区的长度和组成差异是影响CARs的重要因素，最常用的铰链区来自CD8、CD28、IgG1或IgG4的氨基酸序列。跨膜结构域的主要功能是将CARs锚定在T细胞膜上，通常为CD3ζ、CD4、CD8α 或 CD28的跨膜区。胞内信号转导结构域主要由刺激因子CD3ζ链组成，常与CD28、ICOS、OX40(CD134)和4-1BB (CD137)等共刺激分子结合[12-13]，是激活T细胞所必需的“信号器”，可介导细胞增殖、细胞因子分泌和细胞杀伤。

CAR-T细胞历经五代，其主要区别在于特定的共刺激分子不同[1-2]。90年代设计的第一代CAR-T细胞仅包含CD3ζ信号域，由于缺乏共刺激分子，T细胞活化的触发和持久性极不稳定，临床研究显示其疗效有限或无效[14]。为克服这一缺点，第二代CAR-T细胞将CD3ζ与共刺激分子[CD28、4-1BB (CD137)、ICOS、OX40(CD134)等]串联，从而使CAR-T细胞持续增殖，在多种实体瘤中展现更强的抗肿瘤活性[12-13,15-16]。CD28和4-1BB(CD137)为最常见的、美国食品药品监督管理局(U.S. Food and Drug Administration，FDA)批准的共刺激域，均与患者反应率高相关[17]。为了更好地激活T细胞，第三代CAR-T细胞将2个共刺激分子与CD3ζ串联，使细胞因子分泌增多，对癌细胞增殖的抑制作用增强[18]。三代CAR-T细胞在实体瘤中展现不同的疗效[19-20]。通过编码细胞因子的基因，第四代CAR-T细胞在激活时分泌大量炎症细胞因子，如白细胞介素(interleukin，IL)-12[21]、IL-15和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[22-23]等，以进一步增强T细胞应答并招募先天免疫细胞(巨噬细胞和NK细胞等)，从而对抗免疫抑制性肿瘤微环境。或加入自杀基因调控细胞衰竭，以提高CAR-T细胞的安全性和可控性[24]。有研究表明，四代CAR-T细胞在肝癌[25]、三阴性乳腺癌[26]、神经母细胞瘤[27]等显示出显著的抗肿瘤活性。第五代CAR-T细胞也称为“通用型”CAR-T细胞，利用基因编辑技术敲除健康供者T细胞上的T细胞抗原受体和Ⅰ型人类白细胞抗原基因，以降低免疫排斥反应，避免移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)的发生[28-30]。在实体瘤模型中，第五代CARs通过基因改造增强了T细胞增殖、存活及抗肿瘤作用，但第五代CAR-T细胞的安全性和有效性有待研究[28]。

2 CAR-T细胞治疗面临的挑战

2.1 CAR-T细胞靶抗原的选择CARs通过识别并结合特定的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)，进而激活下游信号通路以引发T细胞介导的靶细胞杀伤[2,31]。目前正在研究实体瘤中的多个靶点用于CAR-T细胞治疗，包括人表皮生长因子受体-2、癌胚抗原、唾液酸神经节苷脂2、IL-13Rα、表皮生长因子受体、黏蛋白1和前列腺特异性膜抗原。由于大多数TAA在肿瘤和健康组织上均有表达，CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞的同时会破坏正常细胞，引起“靶向肿瘤外”毒性。同种异体CAR-T细胞的输注甚至导致GVHD的发生。此外，与血液肿瘤相比，实体瘤具有独特的抗原异质性特点，CAR-T细胞优先杀伤靶抗原高表达的肿瘤细胞，且治疗后靶抗原下调和丢失，这种“脱靶效应”不仅削弱了CAR-T疗法的效果，而且使肿瘤细胞能顺利逃避T细胞的免疫监视，从而引起耐药和肿瘤复发[32]。因此，定位适当和特定的靶抗原是实体瘤CAR-T细胞疗法面临的极大挑战。

单抗原靶向CAR-T细胞易诱发耐药性和肿瘤复发。在临床前模型中，双靶向或多靶向CAR-T细胞，如胶质母细胞瘤(HER2/IL13Rα2)、髓母细胞瘤(HER2/IL13Rα2/EphA2)，不仅可以改善抗肿瘤反应，还可以减少抗原逃逸以防止复发，但其安全性仍需进一步研究[33]。此外，将上调肿瘤相关抗原的表达、靶向肿瘤限制性翻译后修饰作为创新策略，以增强特异性抗原识别，以期更有效地控制肿瘤生长。

2.2 CAR-T细胞归巢不良CAR-T细胞的靶向运输和肿瘤浸润能力是实体瘤中CAR-T细胞疗效欠佳的重要原因[34]。肿瘤微环境中一系列屏障的形成阻碍了CAR-T细胞归巢，包括物理屏障(基质成分)、代谢屏障(氧化应激、无氧糖酵解及乳酸堆积)及免疫屏障(可溶性抑制因子、免疫抑制性靶点及细胞)[34-35]。采用局部给药的策略，避免了CAR-T细胞向疾病部位的运输，并限制了靶向外肿瘤毒性。临床前模型已经证明在乳腺癌脑转移瘤、胶质母细胞瘤、恶性胸膜间皮瘤中局部CAR-T细胞治疗具有卓越的效果，相应的临床试验正在进行[36-37]。然而，这种方法受到其高技术复杂性的限制，且局限于单个肿瘤病变/寡转移性疾病。

过表达CAR-T细胞中的趋化因子受体作为另一新策略，可促进CAR-T细胞向高表达同源配体的肿瘤部位迁移，增强T细胞的持久性，并可招募宿主体内的免疫细胞(如树突状细胞等)，从而显著增强抗肿瘤功效[38-39]。这在胰腺癌、卵巢癌[38]、胶质母细胞瘤[39]和恶性间皮瘤[40]等的临床前模型中被证实，其有效性及安全性有待进一步在体内验证。此外，过表达调控基质降解酶的基因、靶向成纤维细胞活化蛋白等策略，可通过调节物理屏障，来提高肿瘤穿透性，以便将治疗效果扩展到复杂的实体瘤和转移灶[41-42]。

2.3 中和免疫抑制微环境CAR-T细胞治疗实体瘤的临床效果受到免疫抑制性微环境的限制，例如缺氧、氧化应激、肿瘤源性细胞因子抑制、免疫抑制性检查点及细胞等[32,35]。既往研究表明，肿瘤细胞可释放多种免疫抑制因子，包括血管内皮生长因子、IL-4、IL-10、转化生长因子-β 和前列腺素E2，激活抑制性免疫细胞(调节性T细胞、髓源性抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞)，从而形成肿瘤免疫抑制性微环境。通过基因工程敲除免疫检查点(程序性死亡受体1、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、淋巴细胞激活基因3等)[29,43]、改造抑制性细胞因子受体[39]、调控代谢及凋亡相关基因[41]等，以逆转CAR-T细胞的耗竭表型，改善实体瘤中的T细胞浸润和功能。在肾细胞癌、黑色素瘤等实体瘤相关的临床前研究中，敲除免疫检查点的CAR-T细胞抗肿瘤活性显著提高，相应的临床试验在食管癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌、转移性肾癌、黑色素瘤、乳腺癌等实体瘤中开展[44]。此外，CAR-T细胞和免疫检查点阻断剂联合疗法被认为是有期望的策略。

2.4 克服CAR-T细胞相关毒性尽管CAR-T细胞在某些类型的癌症患者中取得了持久的临床反应，特别是表达CD19的难治性和复发性B细胞恶性肿瘤，但其可能会发生与诱导强大的免疫效应反应直接相关的毒性[45]。最常观察到的免疫介导的毒性是细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)和免疫效应细胞相关的神经毒性综合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS)。CRS与超生理细胞因子产生和大量体内T细胞扩增有关，可能导致发烧、低血压、缺氧、恶心、疲劳、多器官衰竭，甚至死亡。早期识别和管理CRS的症状和体征，可以预防或逆转大多数患者的器官功能障碍。ICANS的特征是脑脊液细胞因子水平升高和血脑屏障破坏，通常表现为中毒性脑病、癫痫发作、运动无力、脑水肿和昏迷。ICANS通常发生在CRS症状消退后，在大多数无永久性神经功能缺损的患者中是可逆的。设计新的CARs结构以最大限度地降低引发CRS和ICANS的风险，同时优化肿瘤抗原的识别和有效的T细胞信号传导。熟练掌握CRS和ICANS的症状和体征，是早期识别和管理这些并发症的可靠前提。

3 以CAR-T细胞治疗为主导的综合治疗的前景

研究表明，CAR-T细胞单一疗法对实体瘤的疗效有限。CAR-T细胞联合其他治疗的综合性治疗策略，可能作为实体瘤治疗的可发展新策略[46]。目前联合疗法研究主要是在临床前环境中。

3.1 联合放疗放射治疗可诱导肿瘤坏死和细胞凋亡。研究表明，放疗可能是通过增加靶抗原表达、CAR-T细胞浸润和细胞因子/趋化因子表达，以及通过增强内源性靶抗原特异性免疫以促进更持久的反应，间接提高CAR-T细胞的功效[47-48]。此外，放射治疗可能通过促进内皮细胞表面的黏附分子表达显著增加，影响肿瘤血管正常化，从而促进免疫效应细胞的归巢和迁移[48]。

3.2 联合化疗化疗和CAR-T细胞联合治疗具有一定的抗肿瘤协同作用。临床前研究显示，低剂量化疗给药不仅能减轻肿瘤负荷、增强肿瘤细胞对免疫治疗的敏感性，而且具有免疫调节作用，其细胞毒性作用促进了肿瘤抗原的识别和呈递，这有利于中和免疫抑制性细胞，延长CAR-T细胞的持久性[49-50]。

3.3 联合靶向治疗或表观遗传抑制剂抗血管生成剂和检查点抑制剂的组合在多种实体瘤类型的许多临床试验中提供了更强大的治疗选择[51]。大量的临床前和临床证据表明抗血管生成在克服免疫治疗耐药性方面起着关键作用。临床前研究表明，CAR-T细胞与抗血管生成疗法联合使用时，可以通过上调内皮细胞上的黏附分子使肿瘤血管正常化，改善T细胞功能障碍，从而增强T细胞归巢和杀伤作用[52]。另一临床前研究表明，靶向CDK7的小分子抑制剂和EGFR CAR-T细胞的联合治疗可抑制三阴性乳腺癌模型中的免疫耐药、肿瘤生长和转移[53]。

3.4 联合其他免疫治疗T细胞表面免疫检查点受体的获得性表达是介导T细胞衰竭的重要机制。研究表明，添加抗程序性死亡受体1单克隆抗体[52,54]或能够分泌抗程序性死亡受体-配体1的CAR-T细胞[55]可以阻断受体的抑制作用，减少CAR-T细胞的衰竭，从而提高其清除肿瘤的疗效和持久性。同样地，抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体也可增加T细胞活性，改善免疫功能活性[43]。

4 挑战与展望

CAR-T细胞疗法极大地改变了当前肿瘤免疫治疗的模式[1-2,31]。尽管CAR-T细胞疗法正在被广泛研究并在血液系统恶性肿瘤中取得了极大的成功，但其在实体瘤中的安全性和有效性仍不清楚[9]。这与实体瘤中缺乏肿瘤特异性抗原、低水平CAR-T细胞浸润、抑制性肿瘤微环境及CAR-T细胞的毒性等密切相关[10,32,34]。目前许多研究尝试通过选择不同靶抗原、联合共刺激分子、调节促炎性或抑制性细胞因子或阻断免疫检查点等，改善CAR-T细胞的靶细胞杀伤活性，延长其持久性和稳定性，促进免疫细胞归巢，从而提高对肿瘤的清除功效。尽管存在挑战，与放射疗法、化学疗法、靶向疗法或其他免疫疗法的联合疗法新策略仍在不断发展[43,46-47,51,54]，并可能为未来更有效和更安全的治疗提供方向。