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高效液相色谱法分离及测定茶叶中的茶碱*

2022-12-22司晓喜杨语喆张雪花刘志华李振杰张凤梅许志刚

广州化工 2022年21期
关键词:出峰柱温茶碱

司晓喜,杨语喆,张雪花,刘志华,李振杰,何 沛,张凤梅,许志刚

(1 云南烟草化学重点实验室, 云南中烟工业有限责任公司技术中心,云南 昆明 650231;2 昆明理工大学 理学院,云南 昆明 650500)

茶叶品种繁多, 含有多种有益健康的有机成分、微量元素和丰富的生物碱。茶碱虽然在茶叶中的含量远小于咖啡碱,但茶碱却具有重要的药用价值,由于茶碱溶解度低,制成药剂时一般选择易溶的茶碱衍生物,如氨茶碱等。茶碱的化学名为1,5-二甲基黄嘌呤(1,5-Dimethylxanthine)[1]。茶碱类药物具有扩张支气管、抗炎、调节免疫、抑制血小板活性等作用, 是治疗哮喘的常用药物[2]。

测定茶碱的方法包括容量分析法、紫外分光光度法(UV)[3]、高效液相色谱法 (HPLC)[4-5]等。茶碱具有良好的紫外吸收, 采用UV法测定茶碱含量的报道较多。但茶碱与可可碱在270~275 nm波长处均有较强吸收, 传统UV法无法消除可可碱的干扰。在可可碱和茶碱同时存在情况下,Abuirjeie等[6]采用一阶导数光谱法和二级导数光谱法测定茶碱。与UV法的局限与导数光谱法的复杂计算相比较, HPLC法更准确、简便、快捷。茶叶中不仅含有可可碱, 还可能有咖啡因等杂质干扰, UV法无法排除相互干扰, 但HPLC法可对杂质进行分离和准确定量[7]。在样品前处理环节,较低的水浴温度不利于茶碱的释放,随着水浴温度的增加,茶碱更易于溶出[8]。本文采用沸水提取三种茶叶种的茶碱,结合高效液相色谱法进行测定,并对色谱分离条件进行了测定,所建立的分析方法能有效测定茶叶种的茶碱含量。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪,美国戴安公司;C18色谱柱(Venusil MP, 5 μm, 4.6 mm×250 mm);FA2004电子天平,上海蒲春计量仪器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵,河南省予华仪器有限公司;PS-10A超声波清洗机,深圳市洁康洗净电器有限公司;HH-34智能数显恒温水浴锅,巩义市英峪高科仪器厂。甲醇为色谱级,其它试剂为分析纯,水为娃哈哈纯净水。茶叶样品购于昆明当地超市。

1.2 分析方法

1.2.1 样品处理方法

称取干燥茶叶1.0 g,置于500 mL的圆底烧瓶中,加入60 mL煮沸的蒸馏水,并保持微沸状态15 min,趁热抽滤,滤渣用40 mL沸水重复提取2次,合并3次滤液,滤液冷却至30 ℃即可进行色谱分析[9]。

1.2.2 标准溶液的配制

准确称取5 mg 茶碱标准品,置于50 mL 的比色管中,加入甲醇溶液稀释至50 mL后超声处理1 min制得100 mg/L的茶碱标准溶液,然后逐级稀释,得到浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、5、10、15 mg/L的标准溶液,并进行色谱分析。

1.2.3 色谱分析方法

采用Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪检测茶碱,色谱柱为C18柱,检测波长为270 nm,采用甲醇-水为流动相,并对流动相的组成、流速和柱温分别进行优化。定量分析时,采用外标法进行定量,采用峰面积对浓度的线性关系建立标准曲线,进一步分析实际样品种的茶碱。所有进样分析的体积均为20 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相比例的优化

茶碱的极性较强,在C18柱上的保留弱,色谱出峰较早。流动相中甲醇和水的比例由40:60向10:90变化时,出峰时间不断增大,峰面积变化不大,但峰宽逐渐增大(如表1所示)。在流动相比例为20:80时,峰面积与出峰时间适中(如图1所示),且目标峰与溶剂杂峰有较好的分离。因此,选择取流动相中甲醇和水的比例为20:80。

表1 流动相中甲醇-水的比例对茶碱分离的影响

图1 流动相中甲醇-水的比例优化

2.1.2 流速的优化

以比例为20:80甲醇-水为流动相,进一步优化流速。流速由0.5 mL/min向0.9 mL/min变化时,出峰时间不断减小,峰宽不断减小,峰面积也不断减小,且压强逐渐增大(如表2所示)。当流速为0.7 mL/min时,峰面积和出峰时间适中(如图2所示),压强也不会太高。因此,选取0.7 mL/min为最优流速。

表2 流速对茶碱分离的影响

图2 不同流速对茶碱分离的影响

2.1.3 柱温的优化

进一步优化色谱柱的柱温, 柱温15 ℃向35 ℃变化时,出峰时间逐渐减小,峰宽也逐渐减小,峰面积变化不大,压强逐渐减小(如表3所示)。柱温为35 ℃时,出峰时间最佳(如图3所示),峰面积最大,压强适中。因此,选取柱温为35 ℃。

表3 柱温对茶碱分离的影响

图3 不同柱温下茶碱的色谱分离图

2.2 分析方法的建立

流动相为甲醇-水,两者体积比为20:80,流速为0.7 mL/min,检测波长270 nm,柱温为35 ℃,进样体积均为20 μL。线性方程为Y=-0.094+1.24X,线性范围:0.05~15 mg/L,线性相关系数R2=0.9991,检出限为0.017 mg/L。

2.3 样品分析

对从市面上随机购买的三种茶叶样品铁观音,绿茶,红茶进行分析,先按照1.2.1的方法进行样品处理,再进行检测,结果在铁观音与绿茶中检出了茶碱,红茶中未检出茶碱。检出浓度在0.459~5.755 mg/L之间。

2.4 加标回收试验

为了进一步验证方法的适用性,在上述样品分析的基础上进行加标回收实验。在茶叶样品中添加一定量的茶碱标准溶液,样品的加标浓度分别为0.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L。按照1.2.1的方法进行样品处理,样品超声处理3 min,经 0.45 μm滤膜过滤后进样20 μL,平行测定三组。扣除本底值后的回收率在88.9%~112.2%之间,相对标准偏差(RSD)在1.1%~5.4%之间。

图4 实际茶叶样品和加标样品的色谱分析图

表4 三种茶叶样品中茶碱的测定及加标回收结果

3 结 论

建立了沸水提取-高效液相色谱法测定不同茶叶中的茶碱,对色谱分析条件进行了优化,包括流动相组成、流速和柱温。在最优的色谱条件下,测得茶叶中茶碱的浓度在0.459~5.755 mg/L之间,加标回收率在88.9%~112.2%之间,相对标准偏差在1.1%~5.4%之间。

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