正交实验法优化青翘感冒颗粒的提取工艺*

温海涛，朱庄松，欧阳润程，赖 瑜，陈 虹

(梅州市中医医院，广东 梅州 514000)

青翘感冒颗粒由连翘、大青叶、车前草、马鞭草、鬼针草等组成。功效为清热解表，用于上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽喉炎。现收载于《广东省医疗机构制剂规范》第二册。由于制法采用水提醇沉工艺，方中药味所含极性较小的成分没有充分提取，且有研究显示醇沉物亦具有一定的药理活性[1]。为使方中活性成分充分提取，本试验以方中连翘所含连翘苷、大青叶所含靛玉红及浸膏得率作为考察指标，拟采用正交试验法优化青翘感冒颗粒的提取工艺[2-3]。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

Agilent1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；BS110S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；JP080PLUS超声清洗机，深圳市洁盟清洗设备有限公司。

1.2 材 料

连翘苷对照品(供含量测定用，批号：110821-202117)中国药品生物制品检定所；靛玉红对照品(供含量测定用，批号：110717-201805)，中国药品生物制品检定所；乙腈(Honeywell，色谱纯)；水为怡宝饮用纯净水；其他试剂均为分析纯；中性氧化铝(100-200目)，国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 连翘苷及靛玉红含量测定方法

2.1.1 色谱条件

色谱条件：Agilent C18色谱柱(4.6×150 mm，4 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0～8 min，20%A；8～9 min，20%～25%A；9～14 min，25%A；14～15 min，25%～50%A；15～23 min，50%A；23～24 min，50%～20%A；24～26 min，20%A)；进样量10 μL，检测波长：277 nm，柱温：30 ℃，流速：1 mL·min-1，理论塔板数按连翘苷峰计算不得低于3000。

2.1.2 混合对照品溶液制备

精密称取连翘苷、靛玉红对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含0.1926 mg、0.0618 mg上述对照品的溶液，吸取适量过微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

方中各药材分别粉碎，过80目筛，按处方比例称取一定量，置粉碎机中混合均匀，作药材粉末备用。取1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇20 mL，称定重量，超声处理20 min。取出，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，水浴蒸干。以少量70%乙醇溶解，湿法上样，置中性氧化铝柱(100～200目，5 g，内径1.5 cm)，用70%乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干。残渣加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备

按处方比例分别称取缺少连翘和大青叶的阴性对照样品，按“2.1.3”项下方法进行制备，即得。

2.1.5 专属性试验

分别精密吸取上述混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，结果显示，供试品与混合对照品在相同保留时间处有相同的吸收峰，且阴性对照无干扰，本测定方法专属性良好。结果见图1。

图1 HPLC色谱图

2.1.6 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别取上述5种浓度的供试品，按“2.1.1”项下色谱条件测定，以对照品的峰面积为纵坐标，供试品的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到连翘苷回归方程：y=6.1983x+4.0463，R2=1.0000，靛玉红回归方程：y=8.147x-2.265，R2=0.9996。结果表明，连翘苷进样量在0.1926～1.9265 μg范围内与峰面积具有良好的线性关系，靛玉红进样量在0.0618～0.6175 μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.1.7 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，测得连翘苷、靛玉红峰面积RSD均小于1.5%，表明仪器日内精密度良好。

2.1.8 稳定性

取同一份供试品溶液，分别在制备后0、1、3、6、12、24 h内测定，测得连翘苷、靛玉红峰面积RSD均小于1.4%，表面供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验

取“2.1.3”项下备用药粉6份，每份约1 g，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定并计算样品，结果，两种成分的RSD均小于1.0%，显示本测定方法重复性良好。

2.1.10 加样回收率试验

取“2.1.3”项下备用药粉6份，每份约0.5 g，精密称定。加入60%乙醇配制的连翘苷、靛玉红对照品混合溶液(连翘苷0.0354 mg·mL-1，靛玉红0.0125 mg·mL-1)，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定，连翘苷、靛玉红平均回收率分别为102.6%、96.3%，RSD分别为2.5%、1.9%。

2.2 浸膏得率的测定

按照《中国药典》2020年版一部干燥失重法，精密吸取各条件下提取液10 mL，置已经干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算浸膏得率。

2.3 青翘颗粒提取工艺研究

2.3.1 单因素试验

精密称定备用药粉，分别对乙醇浓度[0%(水)，30%，60%，70%，95%]、料液比(1:15,1:20，1:25)、提取时间(30、40、50 min)三个单因素进行考察，对各条件下所制备的样品进行测定，结果见表1。

表1 单因素试验结果

由表1得，乙醇浓度的变化对两种成分的溶出影响较大；料液比和提取时间对连翘苷的提取影响较小，对靛玉红的提取影响较大，分析其原因是由于靛玉红极性较小，使用60%乙醇提取时，增大料液比或增加提取时间可提高其溶出率。综合以上试验结果，确定以乙醇浓度(60%～80%)、料液比(1:15～1:20)、提取时间(30～50 min)进行正交试验。

2.3.2 正交试验的设计

按照L9(34)正交设计，以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)为影响因素，本试验以样品中连翘苷、靛玉红的含量、浸膏得率及提取液用量为评价指标，进行加权综合评分[4]，分值分别为4.5、4.5、1分，以各指标最大值为参照，综合评分Y=(X1-X1max)×4.5+(X2-X2max)×4.5+ (X3-X3max)×1。因素水平见表2，设计结果见表3，方差分析见表4。

表2 因素水平

表3 正交试验设计与结果

表4 方差分析

由正交试验结果及方差分析可知，各因素影响程度依次为A>C>B，因素A有显著影响(P<0.05)，其他因素无显著影响(P>0.05)。综合上述结果，确定本试验的乙醇体积分数为70%；料液比各水平间无显著差异，从节约成本的角度考虑选择1:20作料液比，提取时间为40 min，最终确定本试验最佳提取工艺为A2B2C2。

2.4 验证试验

称取备用药粉1.0 g，共三份，精密称定，加入20倍量70%乙醇，超声40 min，按上述方法测定，结果见表5。

表5 验证试验结果

3 结 论

本试验选取连翘苷、靛玉红及浸膏得率为评价指标，与《中国药典》2020年版收载的连翘和大青叶的相关质量控制指标相符，能较全面的评价提取工艺和产品质量。

方中主药大青叶及其指标性成分靛玉红均有有明确的药理作用[5-6]，原提取工艺为水提醇沉工艺，靛玉红等极性较小的成分提取率较低，其制剂中未能检出靛玉红。结合组方中其他药味的化学成分[7-8]，决定采用醇提法进行试验。

本试验因实验条件限制，未对提取次数进行试验，因此对药材进行粉碎过筛，以期减小实验误差，提高其成分的溶出率。结合中国药典中连翘[9]、大青叶[10]原药材的含量测定和正交试验结果，方中连翘所含连翘苷提取基本完全，靛玉红的提取率为原药材的70%以上。

综上所述，本试验对青翘感冒颗粒的提取工艺进行了研究，建立了连翘苷、靛玉红的含量测定方法，为该制剂的提取工艺优化提供了理论依据。