龟茸壮骨片质量标准提升研究

高英鑫，徐 伟，张衍旭，王野谌，张 雷，祝雨婕，董雪莲*

(1.长春中医药大学，吉林 长春130117；2.吉林省中研药业有限公司，吉林 长春130062)

龟茸壮骨片(WS-5947-(B-0947)-2002)是吉林省中研药业有限公司研发生产的省级独家品种，由鹿茸、龟甲(醋制)、骨碎补、补骨脂、续断5味中药组成，具有温阳补肾、益髓壮骨的作用[1-3]，在临床上常用于治疗中老年人筋骨痿软的辅助用药。按照原国家食品药品监督管理局相关标准，目前龟茸壮骨片中以补骨脂素为对照通过薄层扫描法进行含量测定，以柚皮苷为对照通过薄层鉴别作为质量控制。上述质量控制标准过于简单，难以全面反映和控制龟茸壮骨片的质量。中药复方制剂是由多种有效成分组成，经多靶点、多途径发挥功效，且各味药间经整合而实现其有利于机体的特定终末效应[4]，多指标成分测定已成为质量评价的主要发展趋势[5]。龟茸壮骨片中骨碎补具有疗伤止痛、补肾强骨的作用[6-7]，主要成分柚皮苷是一种黄酮单体物质，具有抗炎和抗氧化作用[8]，可在促进骨形成的同时，抑制骨破坏[9-10]。补骨脂具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效[11]，其主要成分补骨脂素和异补骨脂素是两种呋喃香豆素类化合物[12]，可促进成骨细胞增殖和分化成熟，并抑制其凋亡[13-14]。此两味药组成临床治疗骨质疏松的常用联合药对，二者强强联合，可从多角度对骨损伤进行修补。本研究在现行质量标准的基础上，参考相关文献所用方法[14]，以多指标成分测定入手，建立续断和补骨脂的薄层鉴别方法和骨碎补、补骨脂中柚皮苷、补骨脂素、异补骨脂素含量测定的高效液相色谱法，旨在为龟茸壮骨片质量标准提高和改进提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超声波提取器(功率 250 W、频率 50 kHz，型号为KH-250B)；高效液相色谱仪(型号为1260，配备DAD紫外检测器)；电子分析天平[十万分之一(MS105DU型)与万分之一(EL204型)]。

1.2 药品与试剂

续断对照药材(购买于上海源叶生物科技有限公司)，薄层板(G，10 cm×10 cm)，川续断皂苷、柚皮苷、补骨脂素、异补骨脂素标准品均购自中国食品药品检定研究院；龟茸壮骨片(20201101、20201102、20201103、20201104、20201105)及阴性样品均由吉林省中研药业有限公司提供；甲醇为分析纯；乙酸和甲醇均为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 续断薄层鉴别

取龟茸壮骨片5片，除去糖衣，研细待用。取1 g粉末按2020版《中国药典》“续断”项下薄层方法进行鉴别。将薄层板置于烤板机加热后，可观察到有斑点显现。在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。且阴性无干扰，具有良好的专属性，表明所用方法可用于龟茸壮骨片中续断的鉴别。见图1。

图1 龟茸壮骨片中续断薄层鉴别

2.2 补骨脂薄层鉴别

取龟茸壮骨片5片，除去糖衣，研细待用。取粉末2 g按2020版《中国药典》“续断”项下薄层方法进行鉴别。将展开剂比例调节为正丁烷-乙酸乙酯(2∶1)，喷以显色剂后可观察到在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。且阴性没有出现干扰，具有良好的专属性，表明所用方法可用于龟茸壮骨片中补骨脂的鉴别。见图2。

图2 龟茸壮骨片中补骨脂薄层鉴别

2.3 补骨脂素、异补骨脂素、柚皮苷的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：ZXRBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.05%乙酸溶液-甲醇(65∶35)等度洗脱；柱温：25 ℃；检测波长：246 nm(用于检测补骨脂素及异补骨脂素)、284 nm(用于检测柚皮苷)；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL[12]。

2.3.2 溶液的制备 (1)对照品溶液的制备。精密称取各对照品制成每1 mL混合对照品含柚皮苷0.055 9 mg、补骨脂素0.018 1 mg、异补骨脂素0.016 2 mg的混合溶液。

(2)供试品溶液的制备。取龟茸壮骨片粉末2.5 g，加适量甲醇加热回流提取3 h，放至室温，转移至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀后滤过即得。

(3)阴性供试品溶液的制备。取缺骨碎补、缺补骨脂的阴性样品，按与供试品相同的方法制备即得。

2.3.3 方法学验证 (1)专属性试验。对混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液进样，记录色谱图。观察发现，供试品色谱中，在与对照品溶液色谱相应的保留时间处均有相对应的色谱峰，分离度良好，无杂质峰干扰，阴性样品无干扰。见图3。

注：A.混合对照品；B.供试品溶液；C.补骨脂阴性对照；D.骨碎补阴性对照；E.空白溶液。1.柚皮苷；2.补骨脂素；3.异补骨脂素。

(2)线性关系考察。精密称取柚皮苷对照品加甲醇制成浓度分别为0.465 836、0.372 669、0.186 334、0.093 167、0.046 584、0.023 292 mg/mL的溶液。补骨脂素对照品液加甲醇制成浓度分别为0.108 123、0.058 976、0.032 437、0.016 219、0.009 829、0.004 915 mg/mL的溶液。异补骨脂素对照品加甲醇制备成浓度分别为0.101 189、0.050 595、0.025 297、0.020 238、0.010 119、0.005 059 mg/mL的溶液。按“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X)为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线。经线性关系考察发现，所制标准曲线线性关系良好，见表1。

表1 线性关系考察结果

(3)耐用性试验。取同一份供试品溶液，分别在不同条件下，按照不同色谱条件进样测定，计算柚皮苷、补骨脂素、异补骨脂素含量RSD。结果表明，所用方法耐用性良好，见表2。

表2 各成分耐用性试验结果 (mg/g)

(4)稳定性试验。精密吸取同一供试品溶液及混合对照品溶液各5 μL，分别于配制后的 0、1、2、4、6、8、10、12、14、24 h 按“2.3.1”项下色谱条件进行测定(表3)。观察发现，龟茸壮骨片供试品溶液及对照品溶液中的柚皮苷、补骨脂素、异补骨脂素3个待测成分在室温下放置 24 h 内稳定性良好。

表3 各成分24 h稳定性试验结果 (%)

(5)重复性试验。精密称取龟茸壮骨片样品(批号20201103)2.5 g，平行制备6份供试品测定含量。结果表明，所用方法重复性较好,见表4。

表4 重复性试验结果

(6)加样回收率试验。精密称定已知含量的龟茸壮骨片样品(批号20201103)6份，每份1.25 g 。分别加入与样品中待测成分含有量相当的对照品后进行测定，记录峰面积，计算回收率。结果表明，所用方法回收率符合要求，见表5。

表5 加样回收率试验结果 (n=6)

(7)精密度试验。精密吸取混合对照品溶液5 μL，连续进样6次，测定，记录峰面积，计算RSD。结果柚皮苷峰面积的RSD(n=6)为0.19%；补骨脂素峰面积的RSD(n=6)为0.26%；异补骨脂素峰面积的RSD(n=6)为0.35%。表明所用方法与本仪器的精密度良好。

2.3.8 样品含量测定 取5批不同批次龟茸壮骨片制备供试品溶液，并进行含量测定，记录色谱图，结果见表6。

表6 样品的含量测定结果 (mg·g-1)

3 讨论

本实验对龟茸壮骨片部分标准进行了修订与提高研究，对原标准中未列入的薄层色谱鉴别项的药材进行了薄层色谱研究，在龟甲与鹿茸的薄层鉴别中，因其为动物药成分较为复杂且不易被提取导致薄层鉴别不稳定且很难重现，故决定不将二者薄层方法纳入质量提升标准之中。续断的薄层色谱重现性、专属性好，阴性无干扰，故可列入质量标准正文。在补骨脂的薄层方法研究中，改良了药典中展开剂的比例，以保证所测物质的斑点分离得更好且处于薄层板中央易于观察。在含量测定方法的探索中，选择HPLC法以双波长同时测定三种成分，可以更快更好地对质量进行一定控制。在探索阶段前期，利用DAD检测器的全波长特点进行考量，最终选出最大吸收波长。并依次对柱温、提取方式、提取方法进行考量，对流动相的比例、进样量对峰型及分离度进行考察，最终确定稳定可靠、简洁便利的质量控制方法，并纳入标准正文。本研究成果可用于龟茸壮骨片的质量控制，可为保障其临床用药的安全性和有效性提供保障。