紫草素对鼻咽癌CNE1细胞免疫逃逸的影响

王祥香， 吴李仲， 吴祥基

（琼海市人民医院耳鼻喉科，海南琼海 571400）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是指原发于鼻咽黏膜被覆上皮的恶性肿瘤，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首，患者临床主要表现为回缩性血涕、鼻出血等，随着疾病发展可累及听力受损和吞咽障碍等[1]。鼻咽癌属于中医学“鼻渊”“鼻疽”“鼻衄”“石上疽”等范畴，肺热痰火及肝胆热毒上扰为鼻咽癌发病的主要病机[2]。近年来，从中草药中提取有效的活性成分逐步成为化疗药物研究的热点。紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.或内蒙紫草Arnebia guttataBunge的干燥根，味甘、咸，性寒，归心、肝经，具有清热凉血、活血解毒、透疹消斑的功效，用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤等病证。紫草素（shikonin）是从紫草中提取的小分子萘醌类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等多重药理作用[3]。已有研究表明，紫草素具有显著抗鼻咽癌的作用[4-6]，并能改善肿瘤细胞耐药[7-8]，但其具体作用机制尚不完全明确。肿瘤免疫逃逸是肿瘤形成的关键，也是肿瘤免疫治疗的重要突破口[9]。因此，本研究拟通过体内外实验，观察紫草素对鼻咽癌免疫逃逸的影响，进一步探讨紫草素的抗鼻咽癌作用，以期为临床治疗鼻咽癌提供参考依据。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞来源及培养人鼻咽癌CNE1细胞，购自美国菌种保存中心（ATCC）。CNE1细胞以含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基在37℃、体积分数5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，每隔1 d更换培养液，生长到90%时，取处于对数生长期细胞进行后续实验。

1.2药物、试剂与仪器紫草素（分子式：C16H16O5；分子量：288.3；纯度＞99%），美国Sigma公司生产，批号：S7576；紫杉醇（纯度≥98%），云南汉德生物技术有限公司生产，批号：cp110302。胎牛血清、RPMI 1640培养基（杭州四季青生物工程材料有限公司）；兔抗GAPDH抗体（美国Abcam公司）；兔抗程序性死亡受体1配体（PD-L1）抗体、兔抗叉头样转录因子3（Foxp3）抗体、兔抗维甲酸相关孤核受体γt（RORγt）抗体（美国BD Pharmingen公司）；山羊抗兔IgG（武汉纯度生物科技公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒（上海研谨生物科技公司）。流式细胞仪（天津众立生物科技有限公司）；倒置显微镜（上海豫光仪器公司）；凝胶成像系统及Western Blot电泳系统（北京赛百奥科技公司）；SpectraMax iD5多功能酶标仪（北京普凯瑞生物科技有限公司）。

1.3体外研究

1.3.1 紫草素配制 紫草素溶解于1%二甲基亚砜（DMSO），配制成64 μmol/L溶液，-20℃保存，实验时用RPMI 1640培养基稀释到所需浓度。

1.3.2 分组与干预 人鼻咽癌CNE1细胞重悬后，以1.5×106个/mL接种于96孔板中，分为阴性对照组，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L组及紫杉醇2.5 μmol/L组。阴性对照组CNE1细胞不进行干预；紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L组CNE1细胞分别给予对应浓度紫草素共同培养；紫杉醇2.5 μmol/L组CNE1细胞与2.5 μmol/L的紫杉醇共同培养。均处理24 h。

1.3.3 MTT法测定CNE1细胞活性 将CNE1细胞密度调成5×103个/mL，接种于6孔板中培养，按“1.4”项进行分组与干预，24、48、72、96 h后，按照MTT试剂盒说明书步骤进行操作，最后应用酶标仪于450 nm波长处检测吸光度（OD）值。每组设置3个复孔，实验重复2次。

1.3.4 Hoechst法检测CNE1细胞凋亡情况 将CNE1细胞接种于6孔板中，每孔1×105个细胞，按“1.4”项进行分组与干预。用40 g/L的多聚甲醛溶液固定0.5 h，采用TrintonX-100透明处理，加入5 mg/L Hoechst荧光材料染色，在细胞培养箱中孵育30 min，荧光显微镜下观察，凋亡细胞呈高亮蓝色荧光，未凋亡细胞呈低强度荧光。随机拍照选择5个高倍镜视野，应用ImageJ 1.47i软件分析平均荧光强度。实验重复5次。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.3.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测CNE1细胞Foxp3、RORγt蛋白表达 将CNE1细胞接种于6孔板中，细胞密度为2.5×104个/mL，按“1.4”项进行分组与干预。裂解、离心取上清，BCA法进行蛋白定量，上样、电泳后，将蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，先后与一抗二抗反应[Foxp3（1∶600稀释）、RORγt（1∶1 000稀释）和内参GAPDH（1∶2 000稀释）等一抗4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀释）常温孵育2 h]，加入电化学发光试剂（ECL）显色，曝光，最后应用JY-Clear系统分析各蛋白灰度值，结果以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值比值表示。

1.4体内研究

1.4.1 鼻咽癌裸鼠模型建立 取对数分裂期CNE1细胞备用。取48只健康雄性BALB/c裸鼠，体质量18~22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0006。动物实验按照《实验动物管理条例》规定进行。参考文献方法[5]建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型：无菌环境下于裸鼠侧背部皮下注射1.0×107个/mL单CNE1细胞悬液，10 d后出现绿豆大小的肿瘤块。接种21 d时肿瘤体积在100 mm3以上表示建模成功。

1.4.2 裸鼠分组及干预方法 建模成功后，将鼻咽癌模型裸鼠分为模型组，紫草素低、中、高剂量组和紫杉醇组，另设正常组，每组8只。紫草素低、中、高剂量组裸鼠分别灌胃1.0、2.0、3.0 mg/kg紫草素，紫杉醇组裸鼠腹腔注射2.0 mg/kg紫杉醇，正常组和模型组灌胃0.9%氯化钠溶液。每日1次，连续7 d。

1.4.3 巨噬细胞分离、培养 末次干预后颈部脱臼法处死裸鼠，75%乙醇消毒后放入超净工作台中用不含血清的RPMI 1640培养液腹腔灌洗3次。收集灌洗液以10 000 r/min（离心半径12 cm）离心10 min，收集细胞并进行计数。重悬细胞后接种于6孔板中，放入5%CO237℃孵箱内培养，2 h后弃掉培养液，PBS冲洗2次，再次加入含有10%PBS的RPMI 1640培养基，继续培养24 h。

1.4.4 流式细胞术检测各组巨噬细胞中PD-L1的表达 巨噬细胞培养24 h后，细胞吹打后以2 000 r/min离心（离心半径10 cm）。用PBS重悬细胞，加入PD-L1抗体，5 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）结合物与5 μL碘化丙啶（PI）混合后染色，避光条件下，孵育15 min后注入400 μL结合缓冲液混匀。洗涤3次，上流式细胞仪检测。应用FlowJo 7.6软件进行数据分析。

1.4.5 瘤体质量及抑瘤率 颈部脱臼处死裸鼠，剥离瘤体并称质量，计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型组肿瘤质量-治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%。

1.4.6 Western Blot法检测Foxp3、RORγt蛋白表达 取正常组鼻黏膜组织及其他各组肿瘤组织，关键检测步骤同“1.3.5”项。

1.5统计方法采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组CNE1细胞活性比较表1结果显示：干预24、48、72、96 h时，与阴性对照组比较，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L组及紫杉醇2.5 μmol/L组CNE1细胞活性均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），呈时间和剂量依赖性。结果表明，紫草素可以抑制鼻咽癌CNE1细胞增殖。

表1 各组CNE1细胞活性比较Table 1 Comparison of CNE1 cell activity among various groups

2.2各组CNE1细胞凋亡率比较结果显示：阴性对照组，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L组及紫杉醇2.5 μmol/L组的CNE1细胞凋亡率分别为（2.25±0.15）%、（12.14±0.30）%、（18.50±1.20）%、（24.55±2.25）%及（26.33±2.47）%，多组间比较存在差异（F=228.400，P＜0.001）。与阴性对照组比较，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L组及紫杉醇2.5 μmol/L组CNE1细胞凋亡率升高（P＜0.05）；紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L组间细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；紫草素3.6 μmol/L组细胞凋亡率与紫杉醇2.5 μmol/L组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。如图1所示，Hoechst染色凋亡细胞核呈亮蓝色，呈现分叶、碎片状，表明紫草素可以促进鼻咽癌CNE1细胞凋亡，起到抗肿瘤作用。

图1 Hoechst法检测各组CNE1细胞凋亡结果Figure 1 Results of the Hoechst method for detecting apoptosis of CNE1 cells in various groups

2.3各组CNE1细胞Foxp3、RORγt蛋白表达水平比较表2结果显示：与阴性对照组比较，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L组 及 紫 杉 醇2.5 μmol/L组CNE1细胞中Foxp3蛋白表达水平升高、RORγt蛋白表达水平降低（P＜0.05）；紫草素3.6 μmol/L组组Foxp3、RORγt蛋白表达水平与紫杉醇2.5 μmol/L比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Foxp3、RORγt蛋白电泳结果如图2所示。

图2 各组CNE1细胞Foxp3、RORγt蛋白电泳图Figure 2 Electropherogram of Foxp3 and RORγt proteins in various groups of CNE1 cells

表2 各组CNE1细胞Foxp3、RORγt蛋白表达水平比较Table 2 Comparison of protein expression levels of Foxp3 and RORγt among various groups of CNE1 cells

2.4各组裸鼠巨噬细胞中PD-L1表达比较正常组、模型组、紫草素低剂量组、紫草素中剂量组、紫草素高剂量组及紫杉醇组PD-L1在裸鼠巨噬细胞表达的阳性率分别为（4.50±0.26）%、（55.82±2.50）%、（39.86±2.11）%、（30.43±1.80）%、（18.93±1.37）%及（17.24±1.05）%，多组间比较存在显著性差异（F=118.000，P＜0.001）。与阴性对照组比较，模型组裸鼠巨噬细胞中PD-L1表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，紫草素低、中、高剂量组及紫杉醇组裸鼠巨噬细胞中PD-L1表达水平均降低（P＜0.05）；紫草素低、中、高剂量组间巨噬细胞中PD-L1表达水平比较，存在显著性差异（P＜0.05）；紫草素高剂量组PD-L1表达水平与紫杉醇组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组裸鼠巨噬细胞PD-L1表达的流式细胞术结果如图3所示。

图3 流式细胞术检测各组裸鼠巨噬细胞中PD-L1表达结果Figure 3 Flow cytometry results of PD-L1 expression in macrophages in various groups of nude mice

2.5各组裸鼠瘤体质量及抑瘤率比较表3结果显示：与模型组比较，紫草素低、中、高剂量组及紫杉醇组裸鼠瘤体质量均降低，抑瘤率升高（P＜0.05）；紫草素低、中、高剂量组间瘤体质量及抑瘤率比较存在差异（P＜0.05）；紫草素高剂量组瘤体质量及抑瘤率与紫杉醇组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组裸鼠移植瘤大体形态如图4所示。

图4 各组裸鼠移植瘤大体形态Figure 4 Gross morphology of transplanted tumours in various groups of nude mice

表3 各组裸鼠瘤体质量及抑瘤率比较Table 3 Comparison of tumour mass and tumour inhibition rate among various groups of nude mice （±s）

表3 各组裸鼠瘤体质量及抑瘤率比较Table 3 Comparison of tumour mass and tumour inhibition rate among various groups of nude mice （±s）

注：①P＜0.05，与模型组比较；②P＜0.05，与紫草素低剂量组比较；③P＜0.05，与紫草素中剂量组比较

?

2.6各组裸鼠Foxp3、RORγt蛋白表达水平比较表4结果显示：与正常组鼻黏膜组织比较，模型组裸鼠肿瘤组织Foxp3蛋白表达水平降低、RORγt蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，紫草素低、中、高剂量组及紫杉醇组裸鼠肿瘤组织Foxp3蛋白表达水平升高、RORγt蛋白表达水平降低（P＜0.05）；紫草素低、中、高剂量组间Foxp3、RORγt蛋白表达水平比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；紫草素高剂量组Foxp3、RORγt蛋白表达水平与紫杉醇组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Foxp3、RORγt蛋白电泳结果如图5所示。

图5 各组裸鼠Foxp3、RORγt蛋白电泳图Figure 5 Protein electropherogram of Foxp3 and RORγt in various groups of nude mice

表4 各组裸鼠Foxp3、RORγt蛋白表达水平比较Table 4 Comparison of the protein expression levels of Foxp3 and RORγt among various groups of nude mice （±s）

表4 各组裸鼠Foxp3、RORγt蛋白表达水平比较Table 4 Comparison of the protein expression levels of Foxp3 and RORγt among various groups of nude mice （±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与紫草素低剂量组比较；④P＜0.05，与紫草素中剂量组比较

?

3 讨论

肿瘤微环境中的免疫抑制状态被认为是肿瘤发生和快速发展的主要原因。大量肿瘤相关巨噬细胞、T淋巴细胞等免疫抑制细胞构成了免疫抑制的微环境，在肿瘤逃逸机体免疫应答中发挥了重要的作用。有研究[10]证实，肿瘤相关巨噬细胞表达程序性死亡受体1配体（PD-L1）后肿瘤微环境处于免疫抑制状态。PD-L1属于B7家族的细胞表面糖蛋白，高表达PD-L1的肿瘤相关巨噬细胞主要通过与CD8+T淋巴细胞上的程序性死亡受体1（PD-1）结合介导免疫调节，抑制效应T细胞的增殖、存活，发挥负向调控T细胞活性的作用，并介导其发生凋亡，导致杀伤肿瘤的淋巴细胞数量减少，削弱免疫系统的抗肿瘤效应[11]，但PD-L1+巨噬细胞在鼻咽癌进展过程中的作用尚未明确。本研究通过建立荷鼻咽癌CNE1细胞裸鼠移植瘤模型，采用不同浓度的紫草素干预后提取巨噬细胞，结果显示：紫草素可以下调巨噬细胞中PD-L1的表达，减小瘤体体积，表明紫草素可抑制巨噬细胞PD-L1表达，减少肿瘤细胞免疫逃逸，从而抑制鼻咽癌细胞增殖。

辅助性T细胞17（Th17）与T调节细胞（Tregs）均为CD4+T细胞亚群之一，通过分化与功能的相互拮抗，共同维持机体免疫功能的相对稳定。RORγt是对Th17细胞的分化起关键作用的转录因子，若抑制RORγt的表达，则可抑制未致敏T细胞向Th17细胞分化[12]。研究表明，由炎症反应导致肿瘤细胞中也存在RORγt表达激活[13]。Foxp3被认为是Treg细胞的关键转录因子和特异性标记物，它可通过与染色体结合后，调节多种基因的表达和功能，进而控制Treg细胞的发育[14]。在肿瘤发展过程中，Foxp3降低可促进免疫逃逸[15]。研究表明，鼻咽癌细胞Foxp3活性下降，干预后Foxp3表达升高而发挥抑制肿瘤的作用[16]。转录因子RORγt和Foxp3决定细胞受抗原刺激后是向Th17细胞分化还是向Treg细胞分化的情况，两者的平衡或紊乱决定了机体的免疫状态。本研究结果显示，在鼻咽癌细胞或鼻咽癌裸鼠中均存在Foxp3表达降低、RORγt表达升高，采用紫草素干预后肿瘤细胞Foxp3表达升高，RORγt表达降低，表明紫草素可以上调鼻咽癌Foxp3水平、下调RORγt水平，进而调节鼻咽癌肿瘤微环境中Treg主导的免疫耐受现象。

综上所述，紫草素可以抑制鼻咽癌细胞增殖，抑制瘤体生长，其机制可能与其降低肿瘤微环境巨噬细胞的PD-L1活性，激活肿瘤细胞Foxp3并抑制RORγt表达，进而减少肿瘤细胞免疫逃逸有关。