清燥救肺汤含药血清对非小细胞肺癌细胞恶性行为的影响

张美英， 侯炜， 高坤

（1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.中国中医科学院望京医院，北京 100053）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是指源于支气管黏膜上皮或者肺泡上皮的恶性肿瘤，是肺癌最常见的类型。随着中医药学的发展，中医在治疗肺癌方面取得了显著的成果。肺癌归属于中医学“肺痿”的范畴，燥热伤肺是肺癌的重要病机[1]。清燥救肺汤具有清燥润肺、益气养阴的功效，既往临床和实验研究表明，清燥救肺汤对肺癌有显著的疗效[2-5]，但关于其具体作用机制仍不明确，因此，本研究以NSCLC细胞株H1299为研究对象，进一步观察清燥救肺汤抗肺癌机制，以期为临床治疗提供实验依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验细胞与动物人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株H1299，购自北京科瑞思搏生物科技有限公司。24只SPF级8周龄雄性SD大鼠，体质量180~200 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。动物实验于中国中医科学院广安门医院实验室[动物使用许可证号：SYXK（京）2014-0041]完成。实验方案经中国中医科学院广安门医院伦理委员会批准（批准号：2016-052-KY）。按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.2试剂与仪器干扰素γ（IFN-γ）抗体、白细胞介素4（IL-4）抗体、胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）抗体、信号传导与转录激活因子3（STAT3）抗体，购自沈阳万类生物科技公司；RPMI 1640培养基，购自上海善然生物科技公司；Transwell小室，购自上海生博生物医药公司。蛋白电泳仪，购自北京科普尔科技公司；PCR仪，购自苏州雅睿生物公司；高速离心机，购自武汉益普生物科技公司。

1.3药物及制备清燥救肺汤组成：桑叶（霜）9 g，炙甘草3 g，麦冬10 g，枇杷叶9 g，生石膏12 g，党参12 g，阿胶9 g，苦杏仁9 g。所有中药材购自中国中医科学院广安门医院中药局。常规煎煮后，浓缩生药含量1 g/mL，冷却后4℃保存备用。

1.4含药血清制备适应性喂养2周后，将24只大鼠随机分为空白血清组和含药血清组，每组12只，含药血清组大鼠给予清燥救肺汤5.5 g/kg灌胃，空白血清组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，干预2周[3]。末次灌胃后经大鼠尾部采血，离心，保留血清，56℃水浴灭活，除菌过滤后，-20℃密封冷藏备用。

1.5含药血清干预及分组取第3代NSCLC细胞株H1299，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后以1×106个/孔接种于6孔板，37℃、CO2培养箱中培养，细胞贴壁后更换新鲜的无血清RPMI 1640培养基继续培养。培养1 d后，弃上清。实验分为空白血清组及清燥救肺汤低、中、高浓度含药血清组（简称清燥救肺汤低、中、高浓度组）。空白血清组：NSCLC细胞+10%空白血清培养；清燥救肺汤低浓度组：NSCLC细胞+2.5%清燥救肺汤含药血清+7.5%空白血清；清燥救肺汤中浓度组：NSCLC细胞+5%清燥救肺汤含药血清+5%空白血清；清燥救肺汤高浓度组：NSCLC细胞+10%清燥救肺汤含药血清。给药后继续培养24 h后进行后续实验。

1.6观察指标与方法

1.6.1 平板克隆形成实验观察NSCLC细胞增殖能力 给药24 h后，取各组细胞制备细胞悬液接种于6孔板中常规培养7 d，结晶紫染色，显微镜下观察，计算克隆形成率。克隆形成率（%）=形成的细胞克隆数/接种细胞数×100%。

1.6.2 Transwell细胞侵袭及迁移实验Transwell小室包被基底膜（细胞侵袭实验所需）。制备细胞悬液5×104个/mL，接种到Transwell小室中，继续培养12~24 h。4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，显微镜下随机选取5个视野，计算侵袭、迁移细胞数，取平均值。

1.6.3 PCR法检测NSCLC细胞Th1细胞表型因子IFN-γ及Th2细胞表型因子IL-4及IGF-1R/STAT3通路相关蛋白IGF-1R、STAT3的基因水平PCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性5 s，58℃退火30 s，40个循环。以β-actin作为内参照，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.6.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测NSCLC细胞IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表达 将H1299细胞裂解离心取上清液，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白。IFN-γ（1∶1 000）、IL-4（1∶1 000）、IGF-1R（1∶1 500）、STAT3（1∶1 000）等一抗稀释液4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000）稀释液37℃反应1 h。电化学发光法（ECL）显色，曝光，凝胶成像系统（JY-Clear）分析目标条带的光密度值，结果以目的蛋白灰度值与内参蛋白（GAPDH）灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。

1.7统计方法采用SPSS 21.0统计软件进行数据的统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，两组之间比较采用t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组NSCLC细胞克隆率比较空白血清组及清燥救肺汤低、中、高浓度组NSCLC细胞克隆率分别为（92.15±6.15）%、（83.11±4.16）%、（71.36±4.37）%、（52.31±5.02）%。4组组间比较，差异均有统计学意义（F=71.430，P＜0.05）。与空白血清组比较，清燥救肺汤低、中、高浓度组NSCLC细胞克隆率减小（P＜0.05），呈浓度依赖性。各组细胞克隆情况见图1。

图1 各组NSCLC细胞平板克隆形成实验结果Figure 1 Results of NSCLC cell plate clone formation assay

2.2各组NSCLC细胞侵袭能力比较空白血清组，清燥救肺汤低、中、高浓度组NSCLC细胞侵袭数分别为（148±17）、（111±15）、（84±13）、（62±10）个。4组组间比较，差异有统计学意义（F=42.080，P＜0.05）。与空白血清组比较，清燥救肺汤低、中、高浓度组NSCLC细胞侵袭数量减少（P＜0.05），且呈浓度依赖性。见图2。

图2 各组NSCLC细胞Transwell小室侵袭实验结果（×400）Figure 2 Results of Transwell invasion assay of NSCLC cells（×400）

2.3各组NSCLC细胞迁移能力比较空白血清组，清燥救肺汤低、中、高浓度组NSCLC细胞迁移数量分别为（108.01±11.34）、（85.73±5.14）、（67.33±6.44）、（44.52±6.79）个。4组组间比较，差异有统计学意义（F=72.050，P＜0.05）。与空白血清组比较，清燥救肺汤低、中、高浓度组NSCLC细胞迁移数量减少（P＜0.05），且呈浓度依赖性。见图3。

图3 各组NSCLC细胞Transwell小室迁移实验结果（×400）Figure 3 Results of Transwell migration assay of NSCLC cells（×400）

2.4各组NSCLC细胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3的mRNA表达比较与空白血清组比较，清燥救肺汤低、中、高浓度组NSCLC细胞中IFN-γ mRNA表达水平升高，IL-4、IGF-1R、STAT3 mRNA表达水平降低（P＜0.05），呈浓度依赖性。见表2。

表2 各组NSCLC细胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3 mRNA表达比较Table 2 Comparison of mRNA expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R，STAT3 in NSCLC cells of among various groups （±s，n=6）

表2 各组NSCLC细胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3 mRNA表达比较Table 2 Comparison of mRNA expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R，STAT3 in NSCLC cells of among various groups （±s，n=6）

注：①P＜0.05，与空白血清组比较；②P＜0.05，与清燥救肺汤低浓度组比较；③P＜0.05，与清燥救肺汤中浓度组比较

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2.5各组NSCLC细胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表达比较与空白血清组比较，清燥救肺汤低、中、高浓度组NSCLC细胞中IFN-γ蛋白表达水平升高，IGF-1R、STAT3、IL-4蛋白表达水平降低（P＜0.05），呈浓度依赖性。见表3、图4。

图4 各组NSCLC细胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3的Western Blot电泳图Figure 4 Western Blot electrophoretogram of IFN-γ，IL-4，IGF-1R，STAT3 in NSCLC cells

表3 各组NSCLC细胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表达比较Table 3 Comparison of protein expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R and STAT3 in NSCLC cells among various groups （±s，n=6）

表3 各组NSCLC细胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表达比较Table 3 Comparison of protein expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R and STAT3 in NSCLC cells among various groups （±s，n=6）

注：①P＜0.05，与空白血清组比较；②P＜0.05，与清燥救肺汤低浓度组比较；③P＜0.05，与清燥救肺汤中浓度组比较

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3 讨论

肿瘤的发生是由于多种因素作用导致的，易发生侵袭和转移，而肺癌在所有肿瘤类型中，发生侵袭和转移的概率最高[6]。本研究结果显示，经过清燥救肺汤干预后，NSCLC细胞克隆、侵袭及迁移能力降低，提示清燥救肺汤可抑制肺癌细胞的生长及转移。

肿瘤的发生发展与机体免疫密切相关，机体的抗肿瘤免疫功能主要体现在细胞免疫。T细胞介导的细胞免疫在抗肿瘤免疫中至关重要。Th1细胞表型因子IFN-γ参与细胞毒性T细胞介导的细胞免疫，具有重要的抗肿瘤作用，可诱导NK细胞增强抗肿瘤活性；Th2细胞表型因子IL-4参与速发型超敏反应，通过抑制IFN-γ的产生，防止NK细胞活化，抑制细胞免疫的抗肿瘤效应，促进肿瘤细胞的生长[7-9]。本研究结果显示，经过清燥救肺汤干预后，NSCLC细胞IFN-γ表达升高、IL-4表达降低，提示清燥救肺汤可上调NSCLC细胞IFN-γ表达并抑制IL-4表达，促进Th细胞向Th1型细胞分化，发挥抗肿瘤作用。

IGF-1R/STAT3通路参与多种肿瘤的产生及发展。IGF-1R是一种广泛表达于多种类型细胞表面的酪氨酸激酶跨膜蛋白，主要介导IGF-1和IGF-2的生物学作用，参与机体物质代谢调节及胚胎发育等生物学过程，同时还能刺激肿瘤细胞增殖[10]。已有研究证实，IGF-1R信号通路影响肿瘤细胞的发生、发展、凋亡、各种途径的转移[11-12]。STAT3是IGF-1R/STAT3通路的成员，属于STAT家族成员。有研究[13]表明，STAT3的激活可以促进肺癌发生和肿瘤血管形成，与肺癌的进展和预后密切相关。在相关细胞的作用下，炎症因子通过激活STAT3的表达使其磷酸化后，可特异性地结合在相关因子的基因启动子区，通过启动相关基因的表达促进Th1细胞的分化[14-15]。本研究结果显示，给予清燥救肺汤干预后，NSCLC细胞STAT3、IGF-1R表达随着浓度的增加而降低，提示清燥救肺汤可抑制NSCLC细胞IGF-1R/STAT3通路的活化，发挥抗肿瘤的作用。

综上所述，清燥救肺汤可能通过促进IFN-γ表达，抑制IL-4表达，介导T细胞分化以调节免疫功能，同时抑制IGF-1R/STAT3通路活化，从而抑制NSCLC细胞的恶性行为。