长梗秦艽酮、微小RNA-495-3p质粒对肾癌细胞增殖、侵袭、凋亡及顺铂敏感性的影响及协同作用

劳万生， 范丽霞， 李翠君

（佛山市第五人民医院，广东佛山 528211）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，简称肾癌），是泌尿系统常见的恶性肿瘤，好发于肾实质肾小管上皮[1]。目前，临床治疗早期肾癌以手术切除为主，晚期以内科治疗为主，虽然均对肾癌有一定的疗效，但复发和转移的风险极高，且一部分肾癌患者对化疗不敏感[2-3]。因此，寻找临床综合有效的治疗方法具有重要的研究意义。中药因副作用小、不易耐药等优势越来越受到肿瘤医学界的关注[4]。长梗秦艽（Gentiana wahoniiBurkill.）为龙胆科龙胆属植物，其根可作为秦艽的代用品，主要用于治疗风湿性关节炎及肝胆疾病等[5]。长梗秦艽酮（waltonitone）是从长梗秦艽中分离得到的一个新的乌苏烷型五环三萜化合物[6]，具有显著的体外抗肿瘤活性，对肝癌、宫颈癌、原位胰腺癌、人胰腺导管上皮癌等癌细胞增殖均有抑制作用，可有效调控肿瘤细胞的增殖、细胞周期阻滞、细胞凋亡等过程[7-8]，但对肾癌的治疗作用及机制尚不清楚。有研究发现，微小RNA（miR）是一种内源性非编码RNA，在个体发育，细胞的分化、增殖、凋亡等生理活动中以及在肿瘤的发生、发展等病理过程中起重要的调控作用，与肿瘤耐药性关系密切[9-10]。miR-495-3p是一种多功能mRNA，研究表明，透明肾细胞癌组织中miR-495-3p表达显著低于正常肾组织[11]。本研究旨在探究长梗秦艽酮能否通过协同miR-495-3p，进而调控肾癌细胞的生物学活性及顺铂敏感性，以期为肾癌临床治疗提供新的治疗策略，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞

人肾癌caki-1细胞株，购自于中科院上海细胞库。细胞贴壁生长，2~3 d传代1次，取处于对数生长期的细胞用于实验。本实验取3~5代细胞。

1.2动物

4周龄雄性高度免疫缺陷NOD-SCID-IL-2Rγnull（NSG）小鼠40只，体质量18~21 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。全部小鼠均饲养在无特殊病原（SPF）环境中。动物实验经佛山市第五人民医院实验动物福利伦理委员会批准。

1.3药物及制备

长梗秦艽酮（分子式：C30H48O2；分子量：440.7），其化学结构式如图1所示，由上海中医药大学中药研究所提供，纯度95%以上。将长梗秦艽酮溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成浓度为400 mmol/L的溶液备用，进行后续实验时再稀释成所需的浓度。

图1 长梗秦艽酮的化学结构式Figure 1 Chemical structural formula of waltonitone

1.4试剂与仪器

miR-495-3p质粒（mimics）及其阴性对照质粒（miR-negative control mimics，miR-NC）（中国百奥迈科生物技术有限公司）；转染试剂、Transwell小室（中国赛默飞世尔科技公司）；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）标记液、碘化丙 啶（PI）、LipofectamineTM2000转 染 试 剂、LipofectamineTM3000转染试剂盒（中国上海雅吉生物科技有限公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8）（中国东仁化学科技有限公司）。CO2培养箱（美国Thermo公司）；高速冷冻离心机（美国Tomy kogyo有限公司）；PCR仪（中国上海赛默生物科技发展有限公司）。

1.5体外研究

1.5.1 细胞转染

转染前1 d换液，取处于对数生长期的细胞接种于6孔板，3×105个/孔，待细胞长满约80%时进行miR-495-3p质粒或miR-NC质粒转染，具体步骤按LipofectamineTM2000试剂说明书进行。荧光显微镜下观察转染情况，应用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测是否转染成功。

1.5.2 细胞分组

将培养后的细胞分为空白组，长梗秦艽酮低、中、高剂量组，miR-NC组，miR-495-3p组。空白组：将肾癌caki-1细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中；长梗秦艽酮低、中、高剂量组：将肾癌caki-1细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，分别对应加入10、50、250 μmol/L长梗秦艽酮共同培养；miRNC组：肾癌caki-1细胞转染miR-NC质粒；miR-495-3p组：作为转染组，肾癌caki-1细胞转染miR-495-3p质粒。

1.5.3 CCK-8法检测顺铂诱导caki-1细胞活力和半数抑制浓度（50%inhibition concentration，IC50）

将各组caki-1细胞以1×106个/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔200 μL。分别向培养基中加入7个不同浓度梯度（0、1、2、4、8、16、32 μmol/L）的顺铂。在24、48、72 h时分别加入CCK-8溶液，37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h，用酶标仪于450 nm波长处测定各孔吸光度（OD）值，并计算细胞的IC50值。取3次实验的平均值。

1.5.4 Annexin V-FITC/PI法检测caki-1细胞凋亡

将caki-1细胞用2.5 g/L胰酶消化，制备成密度为1×106个/mL的细胞悬液，用PBS洗涤2次，换用DMEM培养基培养24 h，观察细胞的生长状态，生长状态良好后将细胞收集到离心管中，加入400 μL Binding Buffer缓冲液，细胞重悬，再加入5 μL Annexin V-FITC标记液和5 μL PI，在避光的室温中孵育15 min，然后冰浴5 min，最后应用流式细胞仪进行检测。

1.5.5 Transwell实验测定caki-1细胞侵袭能力

在Transwell上下室之间铺垫聚碳酸酯的微孔滤膜，滤膜上包被人工基底膜胶。用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为5×104个/mL，制成细胞悬液。Transwell上室加入100 μL细胞悬液，下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基500 μL，置于37℃、5%CO2的湿化培养箱中培养24 h。取出细胞并刮除滤膜上室面的细胞，用PBS小心冲洗小室上下面，以40 g/L多聚甲醛溶液固定侵袭或粘附到下室面的细胞30 min，结晶紫染色10 min，PBS冲洗小室，干燥后于200倍光学显微镜下随机选取5个视野计数小室下室面的细胞。

1.5.6 qRT-PCR法检测caki-1细胞中miR-495-3p和XIAP mRNA表达

取各组caki-1细胞，裂解细胞后提取总RNA，逆转录成cDNA，在PCR仪上检测miR-495-3p（内参为U6）和XIAP（内参为GAPDH）的表达情况。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，64℃退火34 s，共40个循环。最后用2-△△Ct法计算目的基因的表达结果。miR-495-3p上游引物序列为5’-GGGGAAACAAACATGGTGCAC-3’，下游引物序列为5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，扩增片段为200 bp；U6上游引物序列为5’-CTCG CTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列为5’-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3’，扩增片段为94 bp；XIAP上游引物序列为5’-CATCCATGGCAGATTAT GAAGCA-3’，下游引物序列为5’-CTTCACTGGG CTTCCAATCAGTTAG-3’，扩增片段为202 bp；GAPDH上游引物序列为5’-GCACCGTCAAGGCTG AGAAC-3’，下游引物序列为5’-TGGTGAAGACG CCAGTGGA-3’，扩增片段为132 bp。

1.5.7 双荧光素酶报告基因靶基因荧光检测

利用生物信息学软件（Target Scan 7.1），预测miR-495-3p调控XIAP基因结合序列，设计合成XIAP 3’-UTR序列及突变后XIAP 3’-UTR序列。将合成的2种目的基因片段分别克隆到pmir GLO荧光素酶报告基因载体，构建XIAP 3’-UTR双荧光素酶报告基因载体（pmir-GLO-wt-XIAP）及其突变型载体（pmir GLO-mut-XIAP）。

使用LipofectamineTM3000分别将这2种重组载体质粒与miR-495-3p质粒或miR-NC质粒（miR-495-3p阴性对照）共同转染至caki-1细胞。转染48 h后，检测荧光素酶活性。实验重复5次。转染分组如表1。

表1 共转染分组Table 1 Co-transfection groupings

1.6体内研究

1.6.1 分组、造模与给药

构建NSG小鼠肾癌移植瘤模型方法：取处于对数生长期的人肾癌caki-1细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，无菌条件下接种于NSG小鼠前肢腋部皮下。在接种前1 d，对NSG小鼠进行250 cGy辐射。接种前通过细胞计数板对细胞悬液进行计数，接种时确保细胞悬液物无外渗，以确保每只小鼠成瘤。接种后隔天观察小鼠，用游标卡尺测量小鼠肿瘤体积，40只小鼠约10 d均成瘤，待肿瘤增长到1 000~2 000 mm3时进行后续实验。将40只NSG小鼠按照随机数字表分为4组，即阴性组、转染组、药物组、联合组，每组10只。药物组：小鼠前肢腋部皮下注射肾癌caki-1细胞1×106个/mL，灌胃30 mg/kg长梗秦艽酮[12]；阴性组：小鼠前肢腋部皮下注射转染miR-NC质粒的肾癌caki-1细胞1×106个/mL，灌胃等体积生理盐水；转染组：小鼠前肢腋部皮下转染miR-495-3p质粒的肾癌caki-1细胞1×106个/mL，灌胃等体积生理盐水；联合组：小鼠前肢腋部皮下注射转染miR-495-3p质粒的肾癌caki-1细胞1×106个/mL，灌胃30 mg/kg长梗秦艽酮。共干预7 d。

1.6.2 肿瘤质量和体积的测量

治疗结束后，取出瘤体，称质量。用游标卡尺测量瘤体的最大长径和短径，计算肿瘤体积。

1.7统计方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组caki-1细胞顺铂敏感性比较

图2-A结果显示：各组0、1、2、4、8、16、32 μmol/L顺铂处理的caki-1细胞活力呈逐渐递减趋势。顺铂为32 μmol/L浓度时，长梗秦艽酮低、中、高剂量组的细胞活力均低于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与miR-NC组比较，miR-495-3p组的细胞活力显著降低（P＜0.05）；长梗秦艽酮高剂量组与miR-495-3p组的细胞活力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明长梗秦艽酮、miR-495-3p质粒均可抑制顺铂处理的肾癌细胞增殖，且高浓度长梗秦艽酮的抑制效果与miR-495-3p质粒相当。

图2-B结果显示：长梗秦艽酮低、中、高剂量组caki-1细胞对顺铂的IC50值均低于空白组，且呈逐渐递减趋势，高剂量组对顺铂的IC50值最低（P＜0.05）；与miR-NC组比较，miR-495-3p组caki-1细胞对顺铂的IC50值明显降低（P＜0.05）；miR-NC组与空白组，及长梗秦艽酮高剂量组与miR-495-3p组caki-1细胞对顺铂的IC50值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明长梗秦艽酮和过表达miR-495-3p均能增强肾癌细胞对顺铂的敏感性。

图2 各组不同浓度顺铂处理的caki-1细胞活力及IC50值比较Figure 2 Comparison of the viability of caki-1 cells treated with different concentrations of cisplatin and IC50 value among various groups

2.2各组caki-1细胞凋亡能力比较

图3、图4结果显示：与空白组比较，长梗秦艽酮低、中、高剂量组细胞凋亡率均显著增加（P＜0.05），呈逐渐递增趋势；miR-495-3p组细胞凋亡率较miR-NC组明显增加（P＜0.05）；miR-NC组细胞凋亡率与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；长梗秦艽酮高剂量组细胞凋亡率与miR-495-3p组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明长梗秦艽酮和过表达miR-495-3p均能促进肾癌细胞凋亡。

图3 流式细胞术检测caki-1细胞凋亡结果Figure 3 Flow cytometry results for caki-1 cell apoptosis

图4 各组caki-1细胞凋亡率比较Figure 4 Comparison of apoptosis rates of caki-1 cells among various groups

2.3各组caki-1细胞侵袭能力比较

空白组、长梗秦艽酮低剂量组、长梗秦艽酮中剂量组、长梗秦艽酮高剂量组、miR-NC组及miR-495-3p组的细胞侵袭数量分别为（125.30±9.52）、（85.11±6.21）、（74.20±4.30）、（50.24±3.66）、（120.41±10.20）及（49.66±4.03）个。与空白组比较，长梗秦艽酮低、中、高剂量组caki-1细胞侵袭能力均显著降低，呈逐渐递减趋势（P＜0.05）；与miR-NC组比较，miR-495-3p组caki-1细胞侵袭能力明显降低（P＜0.05）；miR-NC组caki-1细胞侵袭能力与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；长梗秦艽酮高剂量组caki-1细胞侵袭能力与miR-495-3p组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明长梗秦艽酮和过表达miR-495-3p能抑制肾癌细胞侵袭。Transwell小室细胞侵袭实验结果见图5。

图5 各组Transwell小室细胞侵袭实验结果比较Figure 5 Comparison of the results of transwell chamber invasion assay among various groups（×400）

2.4各组caki-1细胞中miR-495-3p、XIAP mRNA表达比较

图6-A结果显示：空白组与miR-NC组caki-1细胞miR-495-3p呈低表达，差异无统计学意义（P＞0.05）；miR-495-3p组caki-1细胞中miR-495-3p呈过表达，与空白组和miR-NC组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与空白组比较，长梗秦艽酮低、中、高剂量组细胞中miR-495-3p表达水平均明显升高，呈递增趋势（P＜0.05）；长梗秦艽酮高剂量组细胞中miR-495-3p表达水平与miR-495-3p组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明长梗秦艽酮能增强caki-1细胞miR-495-3p表达。

图6 各组caki-1细胞中miR-495-3p、XIAP mRNA表达比较Figure 6 Comparison of expressions of miR-495-3p and XIAP mRNA among various groups of caki-1 cells

图6-B结果显示：与空白组比较，长梗秦艽酮低、中、高剂量组caki-1细胞中XIAP mRNA表达水平显著降低，呈逐渐递减趋势（P＜0.05）；与miR-NC组 比 较，miR-495-3p组caki-1细 胞 中XIAP mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）；miRNC组与空白组，及长梗秦艽酮高剂量组与miR-495-3p组caki-1细胞中XIAP mRNA表达比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明长梗秦艽酮和过表达miR-495-3p均能抑制肾癌细胞中XIAP mRNA表达。

2.5双荧光素酶检测报告

表2结果显示，XIAP的活性可通过过表达miR-495-3p来降低（P＜0.05），进一步证实了XIAP是miR-495-3p的靶基因。

表2 双荧光素酶报告Table 2 Dual-luciferase report （±s）

表2 双荧光素酶报告Table 2 Dual-luciferase report （±s）

注：①P＜0.05，与miR-NC组比较

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2.6各组小鼠肿瘤质量和体积比较

图7结果显示：与阴性组比较，转染组、药物组和联合组的肿瘤质量和肿瘤体积均显著减小（P＜0.05）；联合组的肿瘤质量和肿瘤体积均小于转染组和药物组（P＜0.05）；药物组肿瘤质量和肿瘤体积与转染组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明长梗秦艽酮、过表达miR-495-3p均可抑制小鼠肾癌，且联合抑制效果优于单独使用长梗秦艽酮或过表达miR-495-3p。

图7 各组肾癌小鼠肿瘤质量和肿瘤体积比较Figure 7 Comparison of tumour mass and tumour volume among various groups of kidney cancer mice

3 讨论

肾细胞癌（RCC）是肾脏中常见的一种肿瘤，以对放疗、化疗不敏感为临床主要特点[13]。顺铂（DDP）作为一线化疗药物被广泛应用于治疗各种实体肿瘤，但顺铂破坏DNA交联，诱导核苷酸切除、修复和同源重组，进而导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性[14]。本研究结果显示，长梗秦艽酮组和miR-495-3p组caki-1细胞的活性和对顺铂的IC50值较空白组明显降低，表明长梗秦艽酮、过表达miR-495-3p均能抑制肾癌细胞活性，增加肾癌细胞对顺铂的敏感性，进而降低肾癌细胞对顺铂的耐药。

本研究通过对肾癌caki-1细胞进行长梗秦艽酮干预及转染miR-495-3p后发现，miR-495-3p在肾癌caki-1细胞中呈低表达，在长梗秦艽酮高剂量组caki-1细胞中的表达与在miR-495-3p组中的表达没有明显差异，且miR-495-3p表达随着长梗秦艽酮剂量的增加而升高，表明长梗秦艽酮能增强肾癌细胞中miR-495-3p的表达。

细胞的侵袭能力是决定肿瘤细胞转移能力的潜在指标[15]。细胞凋亡是肿瘤研究的热点，临床上常见的化疗药物包括中药的抗肿瘤机制多可诱导细胞凋亡，从而达到控制肿瘤恶性生长的目的[16]。本研究结果显示，长梗秦艽酮高剂量组和miR-495-3p组caki-1细胞的侵袭能力较空白组明显降低，凋亡能力较空白组明显升高，表明长梗秦艽酮和过表达miR-495-3p均可抑制肾癌细胞侵袭，促进肾癌细胞凋亡，进一步证实了长梗秦艽酮和miR-495-3p的抗肿瘤作用。

X染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）是凋亡抑制蛋白家族中的一员，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子之一，在多数肿瘤中过度表达，介导肿瘤的发生、发展、分期、预后等[17-18]。本研究通过双荧光素酶实验结果显示，过表达miR-495-3p能降低XIAP野生型质粒荧光素酶的活性，表明XIAP是miR-495-3p的靶基因，提示miR-495-3p对肾癌细胞生物活性的调控是通过抑制XIAP来实现的。

本研究通过体内实验，观察长梗秦艽酮、miR-495-3p质粒转染对荷caki-1细胞NSG小鼠肾癌移植瘤模型肿瘤质量和体积的影响，结果显示，转染组、药物组和联合组肿瘤质量和肿瘤体积均较阴性组显著减小，联合组肿瘤质量和肿瘤体积均小于转染组和药物组，表明miR-495-3p质粒可减小肾癌小鼠体内肿瘤的质量和体积，对肿瘤生长具有一定的抑制作用，长梗秦艽酮联合miR-495-3p质粒的治疗效果更为显著。

综上所述，过表达miR-495-3p对肾癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，同时可有效促进肾癌细胞的凋亡。长梗秦艽酮、miR-495-3p可靶向抑制XIAP降低肾癌细胞生物活性，促进肾癌细胞凋亡，抑制肾癌细胞侵袭，增加肾癌细胞的顺铂敏感性，且有一定的协同作用。也进一步提示miR-495-3p可能作为潜在的生物靶点用于肾癌患者的临床治疗，长梗秦艽酮可作为肾癌患者化疗辅助药物。