十一方药酒的体外抑菌作用研究

刘舒凌，黄 娟，唐 杰，陈宏夏，张超裕，屈泽强*

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西农业科学院，广西 南宁 530007)

十一方药酒由广西骨科名老中医梁锡恩所提供的验方制成，为广西中医药大学第一附属医院的传统外用制剂。主要由乳香、没药、红花、自然铜(煅)、续断、龙血竭、三七等药物组成，具有活血止痛、消肿散瘀的功效，用于治疗跌打损伤、骨折筋伤和瘀血肿痛等疾患[1-2]。临床实践表明，十一方药酒用于治疗创伤性出血、创伤性化脓性感染及开放性骨折的伤口处理等取得了显著效果[3]。以往的药理研究发现：十一方药酒对大鼠实验性骨折、兔膝骨关节炎以及大鼠深Ⅱ度烫伤模型均具有治疗作用[4-6]，但目前十一方药酒抑菌作用的研究很少，是否具有抗菌作用尚不十分明确。因此，本研究选取5种受试菌对十一方药酒的体外抑菌作用进行研究，以期为其临床应用提供理论依据，为十一方药酒的进一步开发利用提供实验基础。

1 材料

1.1 试验菌株

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、白色念珠菌(Moniliaalbican)[CMCC(F)98001]、乙型副伤寒沙门菌(Salmonellapara-typhiB)[CMCC(B)50094]、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]以及表皮葡萄球菌 (Staphylococcusepidermidis)[CMCC(B)26069]均由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.2 培养基

琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司，批号：1103581)；水解酪蛋白脲(M-H)肉汤(广东环凯微生物科技有限公司，批号：1103531)。

1.3 药物和试剂

十一方药酒(课题组自制[2]，其浓度为含生药量193 mg/mL的药液，批号：20200302)；白酒(酒精度：50°，南宁军正食品厂)；生理盐水(回音必集团江西东亚制药有限公司，批号：2020103113)；麦氏比浊管(广东环凯微生物科技有限公司，批号：5109227)。

1.4 仪器

SW-CJ-1F型超净台(苏州安泰空气技术有限公司)；生化培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

2 方法2.1 供试液的制备

分别取十一方药酒和白酒，用0.22 μm针头过滤器进行过滤除菌[7]，备用。

2.2 抑菌活性的测定

抑菌活性测定分两步进行，第一步采用琼脂稀释法进行浓度初筛，观察不同浓度十一方药酒对5种受试菌株的体外抑菌效果，测定最低抑菌浓度(MIC)；第二步采用试管二倍稀释法测定十一方药酒对5种受试菌株的最低杀菌浓度(MBC)。

2.2.1 琼脂稀释法抑菌实验 (1)菌悬液的制备。取活化好的菌株，挑取一至多个菌落放入盛有适量生理盐水的无菌试管中，先用生理盐水稀释至1号麦氏比浊管(约为3×108CFU/mL)浓度，再用生理盐水稀释得到1×108CFU/mL菌悬液。

(2)含药平板的制备[8]和分组。①十一方药酒组：取过滤除菌后的十一方药酒原液用生理盐水进行二倍法稀释，配制成浓度为193 mg/mL、96.5 mg/mL、48.25 mg/mL、24.125 mg/mL、12.062 5 mg/mL、6.031 25 mg/mL的系列应用液。吸取各浓度应用液2mL加入已融化的营养琼脂培养基14mL，混合均匀后倾注于直径90 mm的平板中，制成系列含十一方药酒浓度分别为24.125 mg/mL、12.062 5 mg/mL、6.031 3 mg/mL、3.015 6 mg/mL、1.507 8 mg/mL、0.753 9 mg/mL的琼脂平板，其对应的稀释倍数分别为1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256，接种菌液。②阴性对照组：只加等量十一方药酒原液和营养琼脂，不接种菌液。③溶剂对照组：不加十一方药酒，只加等量的营养琼脂和溶剂白酒各系列应用液(将白酒用生理盐水二倍稀释)，得到稀释倍数分别为1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的含白酒平板，接种菌液。

(3)菌液的接种。待上述琼脂平板冷却凝固后，将5种已配置好的菌悬液，吸取100 μL于琼脂平板上均匀涂布，置于37 ℃生化培养箱中培养18～24 h后观察。

(4)MIC的测定。培养结束后，观察各平板是否有菌生长。从无菌生长的平板中找出药液浓度最低的平板，即该平板药物浓度为十一方药酒的MIC[9]。每种菌株平行实验3次。

2.2.2 试管二倍稀释法抑菌实验 (1)菌悬液的制备。取活化好的菌株，挑取一至多个菌落放入盛有适量M-H肉汤的无菌试管中，先稀释至1号麦氏比浊管(约为3×108CFU/mL)浓度，再用M-H肉汤稀释得到1×106CFU/mL的菌悬液。

(2)MBC的测定[10]。取灭菌具塞试管12支，依次编号为1～12。每支试管中先加入1 mL的无菌M-H肉汤，随后在1号试管中加入已除菌的十一方药酒1 mL，用无菌滴管吹打混匀，用移液枪吸取1 mL加入2号试管中，混匀后再吸取出1 mL加入3号试管，依此类推至第9管时，混匀后吸出1 mL弃去。1～9号试管的药液浓度分别为96.5 mg/mL、48.25 mg/mL、24.125 mg/mL、12.062 5 mg/mL、6.031 3 mg/mL、3.015 6 mg/mL、1.507 8 mg/mL、0.753 9 mg/mL、0.377 0 mg/mL。以上1～9号试管均加入细菌近似浓度为1×106CFU/mL的菌悬液100 μL，充分混匀。第10号试管加入1 mL药酒，混匀后吸出1 mL弃去，不加菌液，作为阴性对照，以便观察受试药液是否受污染。第11号试管加入1 mL白酒，混匀后吸出1 mL弃去，再加菌悬液100 μL，作为溶剂对照。第12号试管加入1 mL生理盐水，混匀后吸出1 mL弃去，再加菌悬液100 μL，作为阳性对照(细菌生长对照)。所有样品放入37 ℃生化培养箱中培养18～24 h后观察结果。由于十一方药酒本身带有颜色，并且由于剂型原因加入试管后各管均有一定混浊，为准确判断结果带来一定难度。因此取每管液体50 μL转种于琼脂平板中，用无菌棉签均匀涂布，37 ℃孵育18～24 h，以平板上未见细菌生长的试管所含最低药物浓度为十一方药酒的MBC。每种菌株平行实验3次。

3 结果

3.1 琼脂稀释法抑菌实验结果

结果显示，十一方药酒对5种受试菌种有不同的最低抑菌浓度。十一方药酒浓度≥6.031 3 mg/mL时，金黄色葡萄球菌平皿中无细菌生长；十一方药酒浓度≥12.062 5 mg/mL时，铜绿假单胞菌、白色念珠菌、乙型副伤寒沙门菌、表皮葡萄球菌的平皿中无细菌生长，结果见表1和图1。溶剂白酒在各稀释倍数的平板中均有菌落，结果见表2和图2。因此，十一方药酒对金黄色葡萄球菌的MIC为6.031 3 mg/mL，对铜绿假单胞菌、白色念珠菌、乙型副伤寒沙门菌、表皮葡萄球菌的MIC为 12.062 5 mg/mL。

表1 琼脂稀释法测定十一方药酒的抑菌效果

注：“-”表示没有菌落；“+”表示有少量菌落；“++”表示有大量菌落。

3.2 试管二倍稀释法抑菌实验结果

结果显示，在阴性对照中，试管澄清，表明培养基和药液无细菌污染。溶剂对照(白酒+菌液)的试管混浊，转种琼脂平板后有细菌生长，提示溶剂白酒无明显抑菌作用。十一方药酒在浓度≥12.062 5 mg/mL时，5种受试菌的试管内液体转种琼脂平板后均未见各细菌生长。因此，十一方药酒对5种受试菌的MBC均为12.062 5 mg/mL。结果见表3、图3、图4。

表2 琼脂稀释法测定溶剂白酒的抑菌效果

注：“-”表示没有菌落;“+”表示有少量菌落;“++”表示有大量菌落。

图1 琼脂稀释法中不同浓度的十一方药酒的抑菌效果

图2 琼脂稀释法中不同稀释倍数的溶剂白酒的抑菌效果

4 讨论

感染是骨科临床常见疾病及手术并发症。骨科患者由于开放性损伤、手术切口及手术植入物等易感因素的存在，常并发感染[11]。在骨科患者感染细菌菌群的分布中，以金黄色葡萄球菌、G-肠球菌、铜绿假单孢菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、大肠埃希菌等为主[11-13]。临床研究表明，在全身支持疗法的基础上，以十一方酒湿敷治疗未化脓感染型开放性骨折、十一方酒纱布和拔毒生肌膏交替外敷治疗化脓感染型开放性骨折、术后用十一方酒淋湿伤面，患者的骨折愈合、创面愈合效果良好[3]。目前，十一方药酒的抗菌、抗感染方面的实验研究很少，限制了其推广应用。因此有必要深入系统地进行实验研究，为十一方药酒的应用和开发提供实验依据。

表3 试管二倍稀释法测定十一方药酒的抑菌效果

注：“-”表示试管无细菌生长;“+”表示试管有细菌生长。

图3 试管二倍稀释法中十一方药酒的MBC测定结果

图4 试管二倍稀释法中溶剂白酒的试管转种平皿后的结果

中药体外抑菌实验方法主要分为两类：定性鉴别的抑菌环实验、定量测定的稀释法实验[14]。其中抑菌环实验操作简便，但不够准确，敏感性较低，一般用于药物初期的活性筛选；而稀释法虽操作较为复杂，但稀释法没有中间载体，直接在培养基中反应，不存在吸收和挥发的问题，因而能比较准确地反映样品的抑菌效果，定量评价该药的抑菌性能[14]。在稀释法中，又分为琼脂稀释法和液体稀释法。琼脂稀释法通常把中药加入琼脂中做梯度稀释，观察细菌在药液琼脂中生长和疏密情况；液体稀释法通常在试管中进行，采用肉眼观察法(比浊法)来确定MIC。本研究预实验采用抑菌环实验(纸片法)时发现十一方药酒的抑菌圈很小，而采用稀释法进行实验时却具有抑菌效果，推测原因可能为：其一，由于十一方药酒原液的生药浓度不高，无法达到纸片法的有效抑菌浓度；其二，十一方药酒的抑菌物质不容易由滤纸片扩散进入琼脂。因此，本实验采用稀释法进行十一方药酒的抑菌效果评价。

实验选择了有代表性的实验微生物来评价十一方药酒的抑菌活性。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是G+菌的代表菌种，是骨科创面感染的常见细菌[12]；铜绿假单胞菌是是一种抗性较强的G-细菌，是骨科开放骨折感染创面常见致病菌[12]；乙型副伤寒沙门菌是G-细菌，白色念珠菌为真菌。琼脂稀释法显示：十一方药酒对金黄色葡萄球菌的MIC为6.031 3 mg/mL，对铜绿假单胞菌、白色念珠菌、乙型副伤寒沙门菌、表皮葡萄球菌的MIC为 12.062 5 mg/mL。试管二倍稀释法显示：十一方药酒对5种受试菌的MBC均为12.062 5 mg/mL。综合两种抑菌实验方法的结果，十一方药酒在体外对5种供试菌均有抑菌活性。

由于十一方药酒的溶剂为白酒，因此，实验中用白酒作为溶剂对照。白酒中含有乙醇，一般认为，乙醇能溶解细菌细胞质膜中的类脂，破坏膜结构并使蛋白质变性，体积浓度70%时灭菌力最强，效果最好[15]。本实验显示，白酒在琼脂稀释法中做1∶8倍稀释，试管二倍稀释法中做1∶2倍稀释，5种受试菌均有菌生长，无法达到MIC，说明溶剂白酒的抑菌作用非常微弱，十一方药酒的抑菌作用来源于药物自身存在的抑菌成分。本实验的结果和文献[16]报道的结果有所不同，推测原因可能与不同实验选择的溶剂对照不同以及十一方药酒的制剂工艺不同有关。

综上，十一方药酒体外对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、乙型副伤寒沙门菌、表皮葡萄球菌有抑菌活性。本研究为十一方药酒的功能活性提供了参考，也为其临床应用提供了科学依据。十一方药酒在疾病动物模型中的抑菌作用，以及其抑菌的有效成分，还有待进一步研究。