基于闭环回路气提法的吸烟者唾液成分分析

2022-12-20吴秉宇刘百战

烟草科技 2022年11期

周妍，吴秉宇，费婷，王亮，吴达，刘百战

上海烟草集团有限责任公司技术中心，上海市浦东新区秀浦路3733 号 201315

口腔是感受卷烟烟气的重要器官。卷烟抽吸过程中，部分烟气溶解到唾液中，再传输到味蕾等口腔感受器表面，与其感官神经发生作用，产生不同、多样的抽吸感知。相较于采用吸烟机捕集主流烟气方式进行评价［1-3］，吸烟者唾液中的烟气成分更贴近与感官接触的实际烟气成分，与卷烟品质风格的关系也更为密切。通过研究吸烟者的唾液成分，可进一步明晰影响吸烟者抽吸感受的关键烟气成分。目前，唾液分析在药物［4-5］、类激素［6］、蛋白组学［7-8］及毒品检测［9-10］等方面已有较广泛的应用。但关于吸烟者唾液的研究较少，且多采用模拟方式进行研究。崔杨等［11］应用人工唾液（ISO/TR10271）［12］取代剑桥滤片捕集烟气成分，该方法稳定可靠，捕集的烟气与吸烟者口腔烟气更加接近。李军［13］设计了一种模拟人体感觉器官吸收卷烟主流烟气的装置，使用人工唾液作为仿生液，鉴定出部分对卷烟感官品质有重要作用的香气和香味物质。上述方法仍采用机器机械式吸烟，与消费者实际吸烟行为存在较大差异，且人工唾液与真实唾液仍有一定差距。在真实唾液分析方面，司晓喜等［14］使用Salivette®采样管收集吸烟者唾液，经溶剂萃取及吸附剂分散固相萃取净化后，采用气相色谱-飞行时间质谱法仅分析了9种吡啶类和吡嗪类化合物。FEI 等［15］采用纯净水漱口方式采集口腔液体，开发了吸烟者口腔液体中烟气成分的固相萃取-中心切割二维气相色谱-质谱联用分析方法，分析了约100种烟气香味成分。上述方法为满足唾液复杂基质中低质量分数成分的分析需求，均采用固相萃取技术和特殊分析仪器，前处理较为繁琐，效率较低。因此，本研究中改进并优化了闭环回路气提分析（Closed loop stripping analysis，CLSA）法，对唾液中挥发、半挥发性成分进行高效富集，开发了吸烟者唾液成分的闭环回路气提-热脱附-气质联用分析方法，实现了吸烟者唾液中200余种不同化合物的有效分析，并采用该方法对吸烟者唾液与主流烟气成分的差异以及不同类型卷烟吸烟者唾液成分的差异性进行了研究，旨在为深化研究烟气化学成分与感官的关系提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

医用脱脂棉球（江西维德医疗器械有限责任公司）；玻璃采样管（直径：0.64 cm，长度：8.89 cm，美国Supelco 公司）；成品卷烟（包括6 种中式烤烟型、3 种英式烤烟型和4 种混合型卷烟，市售）；剑桥滤片（44 mm，英国Whatman 公司）；PTFE 滤膜（0.45 μm，美国Agilent 公司）。

TurboMatrix ATD 热脱附仪（美国Perkin Elmer公司）；7890B/5977A GC-MS 联用仪（美国Agilent公司）；CDS Model 9600采样管老化装置（美国CDS Analytical 公司）；SM450 直线型吸烟机（英国Cerulean公司）。

1.2 方法

1.2.1 吸烟者唾液成分收集

吸烟者每天早上9点进行评吸，每次评吸一款卷烟。评吸前需提前用纯净水漱口，连续抽吸完2支相同卷烟后，采用咀嚼刺激法，将固定质量（350 mg）的棉球放入口腔咀嚼3 min后收集。对每种卷烟收集5位吸烟者的棉球，合并后放入样品瓶中。为避免吸烟者个体差异引起的化合物成分及质量分数差异，本实验中的唾液均采集自同一批吸烟志愿者。

1.2.2 卷烟主流烟气粒相物收集

将卷烟样品在温度（22±2）℃、相对湿度（60±2）%下平衡48 h，使用直线型吸烟机按照ISO 3308 标准方法抽吸卷烟［16］，使用剑桥滤片捕集烟气，将捕集了烟气的剑桥滤片放入样品瓶中，用于CLSA 烟气分析。

1.2.3 卷烟主流烟气溶液的制备

采用1.2.2节的方法，使用剑桥滤片捕集烟气，将滤片放入样品瓶后，加入20 mL 超纯水，超声振荡30 min后，取上清液过PTFE滤膜后得到主流烟气溶液，用于CLSA的条件优化。

1.2.4 闭环回路气提法前处理及分析

使用改进的闭环回路气提装置对唾液和剑桥滤片中的烟气成分进行富集。闭环回路气提装置包括电动隔膜气泵、长颈样品瓶、控温水浴锅、冷却水循环系统、加热套和玻璃采样管。如图1所示，样品瓶、采样管与气泵管道连接为循环闭环回路，在样品瓶的瓶颈部设有冷凝装置，温度为4 ℃，同时在采样管前端设有加热套，温度为70 ℃。具体操作：将装有棉球或剑桥滤片的样品瓶持续通过控温水浴加热锅进行加热，加热温度为70 ℃，并使用电动隔膜气泵对样品瓶中的样品吹扫18 h。使用装填有200 mg Tenax 吸附剂的玻璃采样管富集吹扫所得空气中的挥发和半挥发性成分。富集完成后，取下玻璃采样管，使用热脱附-GC-MS技术进行分析。分析条件：

图1 改进后的闭环回路气提装置示意图Fig.1 Schematic diagram of modified closed loop stripping analysis system

（1）热脱附仪条件。一级脱附温度：270 ℃；一级脱附时间：10 min；二级脱附温度：280 ℃；二级脱附时间：8 min；阀温度：250 ℃；传输线温度：250 ℃；唾液样品分流比9∶1；主流烟气样品分流比：99∶1。

（2）GC-MS 条件。色谱柱：DB-WAX 毛细管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气：氦气（≥99.999%）；恒流模式流速：2.0 mL/min；升温程序：40 ℃（5 min）230 ℃（10 min）。接口温度：230 ℃；电子能量：70 eV；EI 源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；质量扫描范围：33～300 amu；采用提取离子法积分峰面积，得到烟气成分的半定量结果。

1.3 化合物的定性及半定量分析

检索NIST图谱数据库对化合物进行定性识别，对匹配度达到90%以上的色谱峰进行定性。

采用提取离子法对色谱峰进行积分得到各化合物的峰面积，作为各挥发和半挥发性成分的半定量分析结果。

1.4 数据处理方法

采用ChemPattern 软件进行偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），以VIP＞1为差异性化学成分。

2 结果与讨论

2.1 闭环回路气提系统的改进

目前，闭环回路气提法因其灵敏度高、可测范围宽、设备组装简单、成本低廉等优点在天然产物及烟草制品挥发性成分分析中均有应用，如邬帅帆等［17］采用闭环回路气提法进行了不同香型、产地烟叶中挥发、半挥发性成分的指纹图谱研究。但传统的闭环回路气提系统的分析对象主要是烟草等天然产物，对于唾液这种含水量高的样品，吸附剂易受到冷凝水的干扰，影响挥发、半挥发性成分的富集效果。因此，需要针对唾液样品含水量高、基质复杂、挥发性成分种类多且浓度低的特点，针对性地开发适用于唾液样品中挥发性和半挥发性成分的分析方法。

本研究中对现有的CLSA 系统进行了改进和优化（图1）。通过在自制长颈样品瓶外增加冷凝装置，使样品中的水蒸气冷凝回流至样品瓶中；并在玻璃采样管前端增加加热模块，能有效避免水蒸气在吸附剂上冷凝而影响吸附剂的性能，从而提高唾液样品中挥发、半挥发性成分的富集效果，实现对含水量高、基质复杂的样品中微量挥发性成分的分析。此外，挥发和半挥发性成分富集于采样管中的吸附剂上，可直接进行热脱附-GC-MS分析，无需化学溶剂萃取前处理，操作更为简便快捷。

2.2 CLSA样品加热温度优化

将滴加2 mL 主流烟气成分溶液的棉球作为模拟唾液样品，置于富集装置的样品瓶中，对CLSA的样品加热温度进行优化。分别考察了不同CLSA样品加热温度（60、70、80 ℃）对化合物峰面积的影响，以几种不同类型、不同沸点的挥发性成分为例（下同），各化合物的色谱峰面积的变化情况如图2 所示。加热温度为70 ℃时，化合物峰面积较60 ℃时明显增大，整体富集效果较好；加热温度80 ℃与70 ℃相比，峰面积变化不大，部分化合物的峰面积略有减小。因此，确定CLSA 的样品加热温度为70 ℃。

图2 CLSA样品加热温度对化合物响应的影响Fig.2 Effects of CLSA sample heating temperature on compound responses

2.3 CLSA样品吹扫时间优化

与2.2 节相同，采用模拟唾液样品考察不同CLSA 样品吹扫时间（12、18、24 h）对化合物峰面积的影响，部分化合物的结果如图3所示。可知，样品吹扫18 h条件下，整体富集效果较好；当吹扫时间增至24 h，化合物响应提升不明显甚至部分略有下降。综上所述，确定CLSA的样品吹扫时间为18 h。

图3 CLSA样品吹扫时间对化合物响应的影响Fig.3 Effects of CLSA sample purging time on compound responses

2.4 分析方法验证

采用模拟唾液样品对所建立的分析方法进行精密度考察。由于检测到的化合物较多，表1中仅列举了部分化合物峰面积的精密度结果。可知，所建立的方法稳定性良好，能够满足吸烟者唾液成分的分析要求。

表1 方法的精密度（n=5）Tab.1 Accuracies of the method（n=5）

应用所建方法对唾液样品进行分析，色谱图基线低、峰型较好，对水基样品中的挥发、半挥发性成分具有良好富集效果。将不同类型卷烟的唾液样品进行混合，分别平行检测5次，共检出能够准确定性且峰面积RSD≤20%的226种不同种类的化学成分，其中，芳香族53种，酮类52种，氮杂环39种，醛类18种，醇类14种，酸类13种，烯烃类11种，酯类8种，氧杂环类6种，生物碱类4种，其他类化合物8种。

2.5 吸烟者唾液与主流烟气中的成分比较

应用所建立的分析方法分别对卷烟主流烟气粒相物和吸烟者唾液中的挥发、半挥发性成分进行分析，以烟碱为基准，分别考察烟气和唾液中各类成分与烟碱的色谱峰面积的比值，比较烟气和唾液中几类关注成分的组成及质量分数的变化情况，主要包括吡啶类、吡嗪类、呋喃类、环戊酮类、环戊烯酮类、环戊烯醇酮类、烯烃类、内酯类、酚类和中性香味成分以及三乙酸甘油酯。

2.5.1 主流烟气和吸烟者唾液中化合物各自与烟碱的色谱峰面积的比值

主流烟气和吸烟者唾液中化合物各自与烟碱的色谱峰面积的比值如图4所示。结果显示：相较于主流烟气，吸烟者唾液中的成分组成发生了较大变化。主流烟气中色谱峰面积较大的成分为酚类化合物和三乙酸甘油酯，峰面积较小的为中性香味成分以及吡嗪类、内酯类和环戊酮类化合物；唾液中峰面积较大的成分为酚类、环戊烯酮类、呋喃类、吡啶类和吡嗪类化合物，峰面积较小的成分为三乙酸甘油酯以及环戊烯醇酮类和内酯类化合物。烟气中色谱峰面积较大的三乙酸甘油酯在唾液中峰面积则较小；烟气中峰面积较小的吡嗪类化合物，在唾液中峰面积则较大；相较于主流烟气，环戊烯酮类、呋喃类和吡啶类化合物在唾液中的峰面积也明显增大。

图4 主流烟气和吸烟者唾液中化合物各自与烟碱的色谱峰面积的比值Fig.4 Ratios of chromatograph peak areas of compounds to nicotine in mainstream cigarette smoke and saliva samples

2.5.2 吸烟者唾液中各类化合物与烟碱色谱峰面积的比值相较于主流烟气的变化程度

唾液中各类化合物与烟碱色谱峰面积的比值和主流烟气中各类化合物与烟碱色谱峰面积的比值的对比结果如图5所示。结果表明：相较于主流烟气，唾液中不同种类化合物的变化程度差异明显。其中，变化最为显著的是环戊酮类、吡嗪类和内酯类化合物以及三乙酸甘油酯，相较于主流烟气，唾液中环戊酮类和吡嗪类化合物的色谱峰面积与烟碱的比值升高达10～30 倍，内酯类化合物和三乙酸甘油酯与烟碱的比值则降低了95%以上。环戊烯酮类、吡啶类及呋喃类化合物的色谱峰面积与烟碱的比值相对于烟气升高了5倍左右。中性香味成分以及酚类、烯烃类和环戊烯醇酮类化合物则变化幅度相对较小，相较于主流烟气，唾液中中性香味成分和酚类化合物的色谱峰面积与烟碱的比值升高2倍左右，烯烃类和环戊烯醇酮类化合物则降低50%左右。烟气成分在唾液中组成比例的变化，可能与物质的亲水程度有关。

图5 吸烟者唾液与主流烟气各类成分对比Fig.5 Comparison of compositions in cigarette smoker’s saliva samples and mainstream cigarette smoke

通过上述各类化合物比例的变化可以看出，吸烟机捕集的主流烟气和吸烟者口腔唾液中的化合物组成及比例存在明显差异，这可能是由于吸烟机标准抽吸模式与志愿者的实际抽吸方式存在一定差异，以及唾液对不同类型化合物保留能力的差异导致的。该结果进一步说明对吸烟者唾液中烟气成分的分析更能客观真实地反映卷烟的感官品质。

2.6 不同类型卷烟吸烟者唾液成分比较

使用所建立的方法对不同类型卷烟样品吸烟者唾液成分进行分析，数理统计结果表明，不同类型卷烟吸烟者唾液成分存在明显差异（图6）。不同类型卷烟吸烟者唾液的差异性成分主要有47种，差异较大的主要为吡啶类、吡嗪类、环戊烯酮类和呋喃类化合物。对不同类型卷烟吸烟者唾液与主流烟气差异成分进行比较，结果（表2）表明，主流烟气差异成分与吸烟者唾液中差异成分有明显区别。

图6 不同类型卷烟吸烟者唾液的OPLS-DA散点图Fig.6 OPLS-DA scatter diagram of saliva of smokers smoking different type cigarettes

表2 不同类型卷烟吸烟者唾液与主流烟气差异成分比较Tab.2 Main different components in saliva of smokers smoking different type cigarettes and mainstream cigarette smoke

对不同类型卷烟吸烟者唾液样品中差异成分的色谱峰面积进行比较（图7），结果表明：①英式烤烟和混合型卷烟吸烟者唾液中吡啶类和吡嗪类成分总体高于中式烤烟型，这与其配方中晾晒烟的使用有关［18］；②中式烤烟型卷烟吸烟者唾液中环戊烯酮类和呋喃类成分总体高于英式烤烟和混合型卷烟，这可能是因为中式烤烟型卷烟中糖的质量分数较高［18］。