海南雪茄烟叶霉变微生物鉴定及拮抗菌株筛选

宋嘉宝，王明锋，罗昭标，曹庆梅，夏长剑，侯宁宁，郭林青，马 林，李 萌，陈德鑫*，饶 智*

1. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道136 号 450001

2. 红云红河烟草（集团）有限责任公司，昆明市红锦路367 号 650231

3. 江西省烟草公司抚州市公司，江西省抚州市迎宾大道1666 号 344000

4. 湖北中向生物工程有限公司，湖北省宜昌市宜都市红花套镇 443300

5. 中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所，海口市红城湖路120 号 571100

6. 四川中烟工业有限责任公司，成都市成龙大道二段与成龙立交交叉口西南200 米 610021

烟叶具有较强的吸湿性且含有微生物生长繁殖所需要的糖类、蛋白质、有机酸等物质，在适宜的条件下容易滋生各种微生物而发生霉变［1-2］。据统计，每年我国烟叶因霉变造成的损失达70 亿元左右［3-7］。引起烟叶霉变的微生物主要为真菌，包括曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、根霉属（Rhizopus）、毛霉属（Muor）和链格孢属（Alternaria）等［8-13］霉变微生物。朱桂宁［14］发现曲霉属微生物是引起广西仓储烟叶霉变的主要微生物，其次是青霉属微生物。晏卫红等［12］从广西钟山、富川和柳州等地烟仓霉变烟叶中分离出曲霉属、青霉属、毛霉属和根霉属霉变微生物，其中曲霉属菌株为优势菌群。烟叶霉变常见的防治方法为化学防治［15-16］、物理防治［17］和生物防治［18］。生物防治具有绿色、无公害且不易产生抗性等优点，已成为烟叶防霉重要的研究方向。赵文姬［18］运用混合平板法从烤烟烟叶表面分离出5株解淀粉芽孢杆菌，通过烟叶防霉试验发现菌株B055具有很强的拮抗效果。朱大恒等［19］从烟草根际土壤分离出1 株对仓储霉变菌株有较强拮抗效果的芽孢杆菌，可以影响霉菌的生长繁殖或使菌丝畸变。

近年来我国雪茄烟消费呈现高速增长趋势，烟叶原料的持续供给是保障雪茄烟产业可持续发展的关键。雪茄烟叶在晾制、发酵和储藏过程中普遍存在霉变现象，而目前烟叶霉变研究主要集中于烤烟和卷烟，有关雪茄烟叶霉变微生物鉴定及生物防治相关的研究报道较少。为此，从海南发生霉变雪茄烟叶上分离、纯化霉变菌株，并筛选致霉菌的拮抗菌株，应用形态和分子生物学相结合的方法鉴定霉变微生物和拮抗菌株，旨在为雪茄烟叶霉变的综合防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

材料：雪茄烟叶（古引4号）采摘于海南省儋州市光村烟田，在海南省儋州市光村镇建恒哈瓦那雪茄有限公司发酵房（平均温度为30 ℃，相对湿度为80%）发酵380 d。采集典型霉变烟叶3.5 kg作为样品。

试剂：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、无水乙醇、香柏油和溴化乙锭核酸染液（郑州翼增生物科技有限公司）；真菌基因组DNA快速抽提试剂盒、细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）通用引物、27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）通 用 引 物、ddH2O、琼脂糖［生工生物工程（上海）股份有限公司］；2×Taq Plus Master Mix II（南京诺唯赞股份有限公司）；经121 ℃灭菌30 min 后的LB培养基（蛋白胨1 g、酵母粉0.5 g、氯化钠1 g、100 ml去离子水）。

仪器：DYY-6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；Vetiti型梯度PCR仪（美国应用生物系统公司）；Mini Bis Pro型凝胶成像分析系统（以色列DNR凝胶成像系统有限公司）；Microfuge 20R 型高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；LX-C35L 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）；N-300M型普通光学显微镜（南京江南永新光学有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 海南霉变雪茄烟叶微生物的分离、纯化和致霉性验证

称取霉变雪茄烟叶10 g，无菌操作接入盛有90 mL 0.9%无菌生理盐水的锥形瓶中，加2 颗玻璃珠，30 ℃条件下180 r/min摇床震荡30 min，得到原始菌悬液，按照10-2、10-3、10-4、10-5进行梯度稀释后涂布于PDA 平板培养基，30 ℃恒温培养箱培养72 h，纯化2 代，得到单一的菌落，编号后置于4 ℃冰箱保存备用。

取适量雪茄烟叶置于培养皿中，121 ℃灭菌锅灭菌20 min，将分离得到的霉变菌株接种于雪茄烟叶表面［13，20］，30 ℃培养5 d，观察菌株对雪茄烟叶的致霉效果（烟叶霉变等级标准［13］：0级，未霉变；1级，叶柄发霉小于1 cm，叶片不发霉；2级，叶柄发霉大于1 cm，叶片不发霉；3级，叶柄发霉，叶片发霉面积为1%～25%；4级，叶柄发霉，叶片发霉面积为26%～50%；5 级，叶柄发霉，叶片发霉面积为50%以上），5 d 后，将烟叶表面霉变菌株接种于PDA 培养基中，观察是否与原菌株一致。

1.2.2 霉菌的鉴定

菌株培养特征观察：将分离得到的单一菌株分别接种至PDA平板培养基中央，于30 ℃恒温培养箱培养，观察菌落的形态特征并拍照。

ITS基因序列的PCR扩增和系统发育树分析：用真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒提取霉菌DNA。使用ITS1 和ITS4 通用引物对DNA 进行PCR 扩增（扩增程序：95 ℃预变性15 min；94 ℃变性50 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；最后72 ℃延伸6 min）。通过琼脂糖凝胶电泳观察产物条带。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果在NCBI数据库进行BLAST同源性比对［21］。利用MEGA软件构建系统发育树。

1.2.3 拮抗菌株的筛选

从海南霉变雪茄烟叶未霉变部位筛选致霉菌拮抗菌。方法同1.2.1中致霉菌的分离与纯化。

将得到的菌株分别与霉菌采用平板对峙法［19，22］进行培养。用打孔器取6 mm菌片接种于PDA培养基中央，筛分出的菌株划线［19］接种于距霉菌2 cm处，单独接种霉变菌株做对照实验，每组菌株3个重复，30 ℃培养5 d，测量并得出平均值，计算R值（R=霉菌菌落向拮抗菌株生长的距离/对照菌落半径），筛选出拮抗菌株并对其进行编号。

1.2.4 拮抗菌株的鉴定

菌株生长特征的检测：对分离得到的拮抗菌株使用平板划线法分别接种到LB 培养基平板中，于30 ℃恒温培养箱培养，观察菌落的形态特征；挑取单菌落边缘菌块至滴有无菌水的载玻片上，用接种环将其涂抹均匀，对菌株进行革兰氏染色［23］，显微镜下镜检并拍照。

分子生物学鉴定：使用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取菌株DNA。用27F和1492R通用引物对拮抗菌株进行PCR 扩增（扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，35个循环；最后延伸7 min）。通过琼脂糖凝胶电泳检测产物条带是否正常。将PCR未纯化产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将检测序列拼接对齐后在NCBI数据库中进行BLAST同源性比对。利用MEGA软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 海南霉变雪茄烟叶微生物菌落形态分析

通过平板涂布法分离纯化得到3株霉变菌株，分别命名为MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1，将菌株分别接种于PDA培养基30 ℃培养5 d后观察。菌株菌落特征及镜检结果见图1。菌株MBYY-A1 在PDA培养基中生长速度一般，菌落为圆形，菌落边缘整齐，中心呈凸起状，菌落表面呈粉末状，菌丝顶部以及菌落边缘呈白色，菌丝内部呈深绿色。在100倍油镜下观察，菌株孢子呈椭圆形，菌丝有隔膜，孢子与菌丝相连呈扫帚状向外延伸。菌株MBYY-B1 在PDA培养基中生长速度较慢，菌落为圆形，边缘整齐，菌落表面较为平整，菌丝长度较短，菌落整体呈土黄色，菌落边缘呈白色。在100 倍油镜下观察菌株孢子呈圆形或椭圆形，菌丝有隔膜。菌株MBYY-C1在PDA培养基中生长速度缓慢，菌落为圆形，边缘整齐，菌落表面不平整，呈棉絮状，菌落整体呈白色，在100倍油镜下观察菌株孢子呈圆形，菌丝有隔膜。

图1 菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1菌落及镜检图像Fig.1 Colonies and microscopic pictures of strains MBYY-A1，MBYY-B1 and MBYY-C1

霉变菌株在雪茄烟叶表面生长情况如图2 所示。由图可见，菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 在无菌雪茄烟叶表面培养5 d 后，烟叶表面均出现大量霉变菌株菌丝，在烟梗处霉变菌株较多，根据1.2.1 中烟叶霉变等级的划分可知3 株霉变菌株对烟叶的致霉性均达到4级。将霉变的烟叶中菌株接种至PDA 培养基中，可再次得到菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1，并且无杂菌出现，证明3株霉变菌株均为雪茄烟叶致霉菌。

图2 菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1致霉性图像Fig.2 Mold causing ability pictures of strains MBYY-A1，MBYY-B1 and MBYY-C1

2.2 霉变微生物的鉴定

PCR 扩增产物在550 bp 处有单一且明亮的条带，可用于菌株鉴定。菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1 的系统发育树如图3～图5 所示。BLAST比对 分析发现，菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 分别与其匹配菌株的序列相似度为100%、100%和99.82%，构建的系统发育树见图3～图5，参考《真菌鉴定手册》［24］相关形态学描述，初步确定菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 分别为Talaromyces funiculosus、Scopulariopsis brevicaulis和Aspergillus occultus，分别属于篮状菌属、帚霉属和曲霉属。

图3 菌株MBYY-A1系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain MBYY-A1

图4 菌株MBYY-B1系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain MBYY-B1

图5 菌株MBYY-C1系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of strain MBYY-C1

2.3 拮抗菌株的分离、筛选与鉴定

2.3.1 拮抗菌株的分离与纯化

通过平板涂布法和对峙平板法筛选出2 株对霉变菌株具有拮抗效果的菌株，编号为a和C25。平板对峙试验菌株拮抗效果如图6所示。经测量计算，可得菌株a 对MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 的R值分别为0.38、0.36 和0.4，菌株C25 对MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 的R值分别为0.33、0.32 和0.47，菌株a和C25拮抗效果良好。

图6 菌株a和C25在PDA培养基中对菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1的抑制效果Fig.6 Inhibitory effects of strains a and C25 against MBYY-A1，MBYY-B1 and MBYY-C1 in PDA medium

2.3.2 拮抗菌株的鉴定

PCR扩增产物在1 500 bp处条带明亮无明显杂带产生，可用于菌株鉴定。在100倍油镜下菌株a和C25 镜检如图7 所示，2 株菌株细胞均呈直杆状、圆端，多以成对或链状排列，革兰氏染色结果为阳性。菌株系统发育树如图8和图9所示，参考《常见细菌系统鉴定手册》［25］可判断菌株a 和C25 均为芽孢杆菌属，分别为Bacillus subtilis和Bacillus halotolerans。

图7 菌株a和C25镜检图像Fig.7 Microscopic pictures of strains a and C25

图8 菌株a系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree of strain a

图9 菌株C25系统发育树Fig.9 Phylogenetic tree of strain C25

3 讨论

从海南霉变雪茄烟叶中分离得到3 株对雪茄烟叶有较强致霉性的霉变菌株，经形态学和分子生物学鉴定分别属于篮状菌属、帚霉属和曲霉属菌株，其中曲霉属微生物是报道较多的烟叶致霉菌，在云南和广西等地烤烟中均有类似报道［14，18］。篮状菌属由于其最初只包括能产生裸囊壳和青霉状帚状枝无性繁殖结构的物种，故而被放在青霉的分类框架中来研究［26］。黄福新等［27］从广西烟仓霉变烤烟中分离出4 个属的霉变菌株，其中就包括青霉属菌株。而由帚霉属引起的烟叶霉变目前还未见报道。

在霉变雪茄烟叶未霉变部位筛选出2 株对霉变菌株有良好拮抗效果的芽孢杆菌，可为雪茄烟叶霉变的生物防治提供参考。目前生物防治雪茄烟叶霉变报道较少，仅见高地芽孢杆菌防控雪茄烟发酵霉变的专利［28］。本研究中仅运用平板对峙法初步筛选出了拮抗菌株，并未将拮抗菌株应用于雪茄烟叶的发酵，未来可模拟雪茄烟叶发酵条件，将芽孢杆菌用于雪茄烟叶的发酵试验，并对发酵条件进行深入研究。

4 结论

采用PDA培养基从海南霉变雪茄烟叶中分离出3株霉变菌株，经鉴定分别为Talaromyces funiculosus、Scopulariopsis brevicaulis和Aspergillus occultus，3 株霉变菌株对雪茄烟叶均具有很强的致霉性。从海南霉变雪茄烟叶中分离纯化出2株拮抗菌株，2株拮抗菌株对霉变菌株的R值在0.32 ～0.47之间，菌株拮抗效果良好。经鉴定，2株拮抗菌株均为芽孢杆菌属，初步鉴定为Bacillus subtilis和Bacillus halotolerans，可作为雪茄烟叶霉变生物防治的候选菌株。