一株麻鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定

原磊 ，路晓

（1. 山东省莱州市金城畜牧兽医站，山东 烟台 261441；2.山东省农业科学院家禽研究所 山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，山东 济南 250100；3.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010000）

新型鸭呼肠孤病毒主要引起雏鸭发病死亡，成年鸭感染不表现症状，但能垂直传播，引起后代雏鸭发病。该病2005年前后在我国南方省份的鸭群中开始出现，后来蔓延至山东、江苏、河南、河北等北方养鸭集中区。目前该病在我国已成为常见病、多发病。发病日龄一般以7～14日龄居多，发病率5%～20%，死亡率1%～10%，一般发病鸭日龄愈小，发病率和死亡率愈高。该病毒能引起患鸭脾脏坏死、法氏囊损伤，导致免疫抑制，极易继发细菌感染，且很难治疗，从而造成更高的死亡率，给我国的养鸭业造成了很大的经济损失[1-4]。

本研究于2022年从山东潍坊地区9日龄发病的麻鸭中分离到一株病毒，鉴定为新型鸭呼肠孤病毒，通过回归试验确定该病毒为致病病原。

1 材料与方法

1.1 病料来源

山东省潍坊地区一家较大规模的麻鸭养殖场，部分9日龄雏鸭前期出现采食下降，精神不振，消瘦，后期趴窝不起，死亡。剖检死亡雏鸭发现，脾脏坏死，其它内脏器官无明显病变，故取病变脾脏用于病原分离。

1.2 材料和试剂

樱桃谷鸭胚和雏鸭购自山东潍坊某种鸭场。

DNA/RNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自AXYGEN公司；一步法RT-PCR试剂盒、PCR Mix、pMD18-T载体、受感态细胞DH5ɑ购自北京全式金公司。

1.3 细菌分离

在无菌条件下，用接种环从脾脏病料中接种细菌于含3%小牛血清的营养琼脂，分别在需氧和厌氧条件下培养48 h，观察有无细菌生长。

1.4 病毒分离

取病变脾脏，加入5倍体积生理盐水和终浓度500 U/mL的双抗，用无菌手术剪剪碎后充分研磨，然后反复冻融3次，6 000 r/min离心20 min，取上清用0.22 μm滤器过滤除菌，接种10日龄鸭胚，0.2 mL/枚，共5枚。收集接种24 h后死亡的鸭胚，并观察死胚的病变情况。利用鸭胚继续传3代后，标记为WF22，-30 ℃冻存备用。

1.5 病毒鉴定

1.5.1 RT-PCR鉴定 参照NCBI中发表的新型鸭呼肠孤病毒S3基因序列设计一对引物。引物序列为：上游引物 P1：5' TAGAGCGGGTTGGAAGATGA 3'；下游引物 P2：5' CCACGCTCAAATTGACCAG 3'，预期扩增片段大小为315 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司（青岛）合成。按照DNA/RNA提取试剂盒说明提取病毒核酸，利用上述引物进行RT-PCR扩增。同时进行番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、1 型鸭甲肝病毒（DHAV-1）、3 型鸭甲肝病毒（DHAV-3）、鸭瘟病毒（DPV）、鸭坦布苏病毒（TMUV）、鸭星状病毒（DASTV）、鸭新型细小病毒（NDPV）、鸭圆环病毒（DCV）等其它常见鸭病毒病核酸检测。

1.5.2 对鸭胚的致病性 将分离毒作10倍系列稀释，取 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五个稀释度经尿囊腔途径分别接种10日龄鸭胚，0.1 mL/胚，37 ℃继续孵育，每天观察两次，直至第7天，记录鸭胚死亡情况，并观察死胚的病变。按Reed-Muench法计算病毒的半数致死量（ELD50）。

1.6 雏鸭回归试验

将WF22株第3代鸭胚毒经腿部肌肉接种5日龄雏鸭，0.2 mL/只，共10只；同时用生理盐水接种5只相同雏鸭作为对照。每天观察试验鸭的症状，直至第7天。死亡试验鸭进行剖检，未死亡鸭第7天剖杀后，观察内脏病变。采集病变明显的脾脏组织，按1：5的比例加入生理盐水，匀浆后冻融两次，然后离心、过滤，经尿囊腔接种10日龄鸭胚，观察死亡鸭胚的病变情况，并收集死亡鸭胚的尿囊液，进行新型鸭呼肠孤病毒核酸检测。

1.7 σC 基因测序与进化分析

参考GenBank登录的新型鸭呼肠孤病毒S1基因序列（KJ879930），设计1对引物（P3/P4），引物序列如下：P3：5' CGAGTATCTTTGT ACGCTACGC 3'；P4：5' TCATCGCGCGCCACAG C 3'，预期片段大小为1 020 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司（青岛）合成。提取WF22株第3代鸭胚毒的RNA进行扩增，取5 µL反应产物在1.5%琼脂糖中电泳进行检验。按照DNA凝胶回收试剂盒说明回收PCR产物，与pMD18-T载体连接后，转化DH5ɑ。挑单菌落扩大培养并提取质粒进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落送北京擎科生物科技有限公司（青岛）进行测序。利用MEGA软件，将WF22株的σC基因与GenBank登录的禽呼肠孤病毒基因序列进行比对分析，并绘制进化树。

2 结果与分析

2.1 细菌分离

从坏死的脾脏中未分离到细菌。

2.2 病毒分离鉴定

2.2.1 病毒分离 将临床采集的脾脏组织处理后经尿囊腔接种10日龄鸭胚，60 h后鸭胚开始出现死亡，死亡鸭胚全身广泛性出血、肝坏死（图1）。

图1 WF22接种鸭胚出血情况

2.2.2 病毒核酸检测 提取分离毒株的DNA和RNA，利用PCR或RT-PCR方法对新型鸭呼肠孤病毒等9种常见鸭病病原进行核酸检测，发现只有新型鸭呼肠孤病毒为阳性，其它均为阴性（图2）。

图2 病毒核酸检测电泳图

2.2.3 对鸭胚的致病性 将WF22第3代鸭胚毒接种10日龄樱桃谷鸭胚，结果显示，其毒价为106.00ELD50/0.1 mL。

2.3 雏鸭回归试验

将WF22第3代鸭胚毒注射5日龄雏鸭，结果发现，攻毒后第3天部分试验鸭开始出现精神不振，采食量和饮水量下降等症状，第6天发病鸭恢复正常，至第7天无试验鸭死亡。剖检发现，试验鸭均出现脾脏坏死的典型病变（图3）。将试验鸭的坏死脾脏处理后接种10日龄鸭胚，结果发现，接种后3～6 d内鸭胚死亡，死亡鸭胚通体出血，经RT-PCR检测，新型鸭呼肠孤病毒核酸为阳性。

图3 WF22攻毒后脾脏坏死

2.4 σC基因测序与分析

利用设计的引物对WF22株的σC基因进行扩增、克隆、测序，并利用MEGA软件绘制进化树。结果发现，其σC基因大小为966 bp，与新型鸭呼肠孤病毒基因序列的进化关系较近，同源性在93.6%~99.7%之间，而与番鸭呼肠孤病毒（MDRV）和鸡呼肠孤病毒（CRV）进化关系较远（图4）。

图4 WF22株σC基因遗传进化分析（黑色三角形表示重点突出本分离株）

3 讨论

目前，我国水禽呼肠孤病毒感染日益严重，宿主范围不断扩大，临床病变趋于复杂，严重危害着我国水禽养殖业的发展。水禽呼肠孤病毒病主要分为番鸭呼肠孤病毒病和新型鸭呼肠孤病毒病两种。由番鸭呼肠孤病毒引起的番鸭或鹅“白点病”，主要表现肝脏有白色或黄白色坏死点，该病毒仅引起番鸭和鹅发病，对其它品种的水禽不发病。由新型鸭呼肠孤病毒引起的鸭鹅“脾坏死病”，主要表现脾脏坏死，该病毒宿主广泛，可感染樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭、野鸭、鹅等多个水禽品种。这两种呼肠孤病毒无论从流行病学、临床症状和病理变化，还是从基因序列和血清学等方面均表现出较大的差异[5-8]。

自新型鸭呼肠孤病毒病在山东地区流行以来，主要发生在樱桃谷鸭上，其它品种的鸭较为少见。本研究从山东潍坊地区临床发病的麻鸭中分离到一株新型鸭呼肠孤病毒，该病毒在鸭胚上生长良好，引起胚体出血、胚肝坏死等病变；雏鸭攻毒试验完全能回归出临床症状与病变；基于σC基因的进化树分析发现，本研究分离到的麻鸭源新型鸭呼肠孤病毒与樱桃谷鸭、绿头鸭、鹅等来源的毒株无明显差异，同源性在93.6%~99.7%之间，这说明不同品种水禽来源的新型呼肠孤病毒在主要抗原基因上基本一致。