侵染西葫芦的中国南瓜曲叶病毒的检测及序列分析

袁晓伟,史慧娴,郭仰东,李兴盛,孙西苹

(1.华盛农业集团股份有限公司,青州 262500;2.中国农业大学园艺学院,北京 100193)

中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)是世界范围内危害葫芦科作物的一种重要病毒,属于双生病毒科Geminiviridae菜豆金黄花叶病毒属Begomovirus,其基因组为双组分,包含DNA-A和DNA-B基因组[1]。该病毒由烟粉虱Bemisiatabaci以持久、循回的方式传播,不能经机械摩擦或种子传播[2]。受侵染的葫芦科作物表现为植株矮小,叶片皱缩,叶边缘向下卷曲,造成葫芦科作物严重的经济损失[3]。

国内外关于SLCCNV的研究主要集中在基因组序列、编码的蛋白组成及新寄主的发现等方面,2003年在印度首次发现SLCCNV-[Pumpkin:Coim]分离物引起南瓜叶片黄化、皱缩[4];同年在越南通过全基因组分析首次证实SLCCNV引起南瓜叶片黄化、植株矮小[5];2011年在印度瓦蜡纳西地区首次证实SLCCNV引起西葫芦花叶、叶片皱缩[6]。

在中国菜豆金黄花叶病毒属病毒可以侵染南瓜、烟草及番茄等[7-9]。1994年我国首次报道了双生病毒侵染南瓜,根据其外壳蛋白cp基因序列分析该病毒可能是SLCCNV[10],但SLCCNV侵染西葫芦在国内尚未见报道。2019年秋在山东省青州市设施栽培的西葫芦大面积暴发病毒病,田间症状表现为植株矮化,叶片卷曲,损失惨重,发病西葫芦种植大棚损失严重甚至造成绝产。经过PCR检测发现并非西葫芦常发的黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus,WMV)、小西葫芦黄化花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)所致。2020年春季,山东省青州市设施西葫芦也同样出现类似病毒病症状,病害的连年发生引起了我们的注意,我们怀疑是一种新的病毒侵染所致。因为观察田间症状与SLCCNV侵染南瓜的症状相似,因此我们对10份病样进行病叶采集和特异性引物的PCR扩增,并对PCR产物进行序列分析比对,以明确引起此次西葫芦病毒病的病原。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料:在山东省青州市试验大棚内从表现叶片皱缩、叶边缘向下卷曲、矮化症状的西葫芦植株上随机采集10份新叶材料,以健康的西葫芦新叶作阴性对照。

试剂:提取DNA的试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。

引物合成和基因测序均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1田间西葫芦样品的病毒检测

采用CTAB方法提取叶片总DNA,具体步骤按照天根试剂盒说明书进行(TIANGEN DP350-02)。

从GenBank中查找SLCCNV基因序列,设计引物SLCCNV-729AF/SLCCNV-729AR和SLCCNV-808BF/SLCCNV-808BR(表1),进行PCR扩增。PCR扩增体系为20 μL:10×EasyTaqBuffer(Mg2+):2 μL,High Pure dNTPs:1.6 μL,EasyTaqDNA Polymerase(5 U/μL):0.2 μL,DNA:1 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL,补双蒸水至20 μL。PCR扩增条件:95℃ 3 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,34个循环;72℃ 5 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收送生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。为了进一步证实该病毒,根据获得的基因序列,依据SLCCNV基因组特征设计了引物SLCCNV-AF/SLCCNV-AR和SLCCNV-BF/SLCCNV-BR(表1),分别扩增DNA-A和DNA-B全长基因。

表1 扩增中国南瓜曲叶病毒基因所用引物Table 1 Primers for amplifying squash leaf curl China virus gene

1.2.2系统进化树分析

根据测序获得的SLCCNV全长基因序列,在GenBank数据库中利用BLAST进行相似性搜索,进一步用ClustalX进行多重序列比对,系统进化树分析采用MEGA 6.0的邻接法(neighbor-joining,NJ),bootstrap为1 000[11]。

1.2.3致病性测定

从发生病毒病的西葫芦叶片上取烟粉虱放入800目网兜,将装有烟粉虱的网兜套在健康的西葫芦幼苗上进行病毒接种。每株健康的西葫芦幼苗上放20头可能携带病毒的烟粉虱,3 d后,使用杀虫剂噻虫嗪对烟粉虱进行喷杀并取下网兜,西葫芦幼苗正常管理2周后统计发病情况,并用PCR检测多头混合的烟粉虱及接种后的西葫芦植株。本试验设3个重复,共接种30株西葫芦幼苗。

2 结果与分析

2.1 田间症状观察

田间西葫芦不同生长时期,感病的西葫芦幼苗和成株均表现为幼嫩叶片黄化、叶边缘向下严重卷曲现象,同时出现植株矮小(图1)。

图1 疑似感染中国南瓜曲叶病毒的西葫芦在幼苗期(a)和初花期(b)的田间症状Fig.1 Field symptoms of zucchini plants suspected of being infected with squash leaf curl China virus at seeding stage (a) and early flowering stage (b)

2.2 疑似感染中国南瓜曲叶病毒西葫芦的PCR检测结果

利用引物SLCCNV-729AF/SLCCNV-729AR和SLCCNV-808BF/SLCCNV-808BR分别对田间采集的10份表现症状的西葫芦叶片进行PCR扩增,结果均扩增到了目的条带,分别为729 bp和808 bp,而健康样品未扩增到目的条带(图2),经对PCR扩增产物测序发现DNA-A片段序列与已登录的SLCCNV一致性范围为90.27%～99.56%,其中与我国广东的SLLCCNV-GDHY南瓜分离物(MW389917.1)一致性最高,为99.56%,DNA-B片段序列与已登录的SLCCNV一致性范围为81.04%～97.28%,其中与我国广东的SLCCNV-GDHY南瓜分离物(MW389918.1)一致性最高,为97.28%。

图2 西葫芦样品PCR检测SLCCNV电泳图Fig.2 Electrophoresis of PCR detection of SLCCNV from zucchini samples

为了进一步获得SLCCNV(西葫芦分离物)的全长序列,我们设计了引物SLCCNV-AF/SLCCNV-AR和SLCCNV-BF/SLCCNV-BR分别扩增DNA-A和DNA-B全长序列,经过PCR扩增及测序后,分别获得全长基因序列DNA-A 2 730 bp和DNA-B 2 711 bp,并上传GenBank注册号分别为OM692270.1和OM692269.1,由于该病毒是在山东西葫芦上首次发现,将其命名为SLCCNV-SD。为明确SLCCNV-SD基因组序列与其他分离物核苷酸差异,本研究选取了NCBI部分SLCCNV分离物的核苷酸序列进行了比较分析,结果表明SLCCNV-SD DNA-A和DNA-B与其他分离物的核苷酸一致性分别为89.65%～99.42%和81.82%～97.29%,并且SLCCNV-SD DNA-A 和DNA-B核苷酸序列均与SLCCNV GDHY南瓜分离物(MW389917.1和MW389918.1)的一致性最高,分别为99.42%和97.29%。

2.3 进化树分析

在GenBank数据库中,分析获得的DNA-A和DNA-B序列与已报道的其他分离物之间的亲缘关系。分别将SLCCNV-SD DNA-A和DNA-B序列与亲缘关系最近的20个SLCCNV分离物的DNA-A和DNA-B序列进行系统进化分析。结果显示,SLCCNV-SD与我国广东的SLCCNV-GDHY南瓜分离物聚为一类(图3)。

图3 SLCCNV-SD DNA-A(a)和DNA-B(b)与其他分离物的进化树构建Fig.3 Phylogenetic tree of SLCCNV-SD and other isolates based on DNA-A (a),DNA-B (b)

2.4 SLCCNV致病性验证

为了验证SLCCNV对西葫芦的致病性,从田间发病的西葫芦植株上收集可能携带病毒的烟粉虱,接种到30株健康西葫芦幼苗上,2周后有29株观察到明显病症(图4)。为了进一步确认发病植株是受SLCCNV侵染所致,收集了田间自然发病西葫芦叶片、人工接种发病西葫芦叶片及传播病毒的烟粉虱进行PCR检测。结果显示田间自然发病西葫芦叶片、人工接种发病西葫芦叶片及烟粉虱内均能检测到该病毒(图5)。因此,我们推测烟粉虱可携带SLCCNV传染西葫芦幼苗引发病毒病。

图4 人工接种后发病的西葫芦植株表现症状Fig.4 Symptoms of zucchini plants after artificial inoculation with SLCCNV

图5 SLCCNV的PCR检测电泳图Fig.5 Electrophoresis of PCR detection of SLCCNV

3 结论与讨论

本研究首次报道了山东省的西葫芦病样中检测到SLCCNV,SLCCNV-SD DNA-A序列与印度、孟加拉国、越南、澳大利亚、泰国、菲律宾6国以及我国7个不同省(市)的59个SLCCNV分离物相似性均在90% 以上,其中与我国广东的SLCCNV-GDHY南瓜分离物相似性最高,为99.42%,SLCCNV DNA-B序列与越南、泰国、印度、菲律宾、印度尼西亚、孟加拉国、巴基斯坦7国以及我国5个不同省(市)的35个SLCCNV分离物相似性在81%以上,其中与我国广东的SLCCNV-GDHY南瓜分离物相似性最高,为97.29%。

进化树分析结果表明SLCCNV-SD西葫芦分离物有可能来自其他葫芦科作物,进一步推测出侵染山东西葫芦的病毒可能是植物材料的流通以及烟粉虱的活动所导致。SLCCNV寄主范围的增加以及其适应性的增强,暗示SLCCNV有可能更大规模发生,危及葫芦科作物的健康生产。除此之外,烟粉虱已经成为蔬菜类作物中传播病毒的灾害性介体之一,再加上设施大棚的大量使用,给烟粉虱提供了周年生长的适宜环境,随着烟粉虱的迁飞和活动,SLCCNV的侵染范围会逐渐增加。本研究在山东西葫芦上检测到了SLCCNV,为开展SLCCNV在我国的扩散、种群遗传特征分析、病毒变异与进化等研究提供了素材,并为西葫芦的病毒防控提供了参考依据。接下来可以继续深入研究该病毒的分子特征及致病机制,分析病害的发病规律为防治该病害的大规模发生提供理论支撑。