6种杀菌剂对梨火疫病菌的室内毒力测定和混配试验

刘朋飞,王 岩,王泓力,吴曰福,陈小飞,楼兵干*

(1.浙江大学生物技术研究所,农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室,杭州 310058;2.新疆林业科学院现代林业研究所,乌鲁木齐 830002;3.塔里木大学农学院,阿拉尔 843300)

由解淀粉欧文氏菌Erwiniaamylovora引起的梨火疫病是梨、苹果等蔷薇科仁果类植物上的一种毁灭性细菌病害,是重要的国际植物检疫性病害[1]。病原菌通常从幼嫩组织的自然孔口侵染,侵染初期花、嫩梢和幼果有水渍状病斑,气候湿润时有菌脓渗出,后变黑枯萎,如果不及时在病健交界以下30～50 cm剪除病枝,采取有效药剂进行防治,病原菌会继续沿枝条上下扩展,当年即可导致大枝枯死或整株死亡。

梨火疫病自18世纪80年代在美国纽约州首次发现至今,已传播至全球50多个国家和地区[2],近年来,我国新疆和甘肃也有梨火疫病发生[3],严重威胁着我国梨、苹果产业的发展。梨火疫病防控措施除了加强检验检疫,严禁从病区调运苗木与接穗外,对老病区和常发区,国内外采取的主要防控措施是化学药剂防控。国际上使用的化学药剂主要有两大类:抗生素类如硫酸链霉素、土霉素、春雷霉素等,铜制剂类如碱式硫酸铜、氢氧化铜、王铜等[4]。链霉素兼具预防和治疗效果,防治效果稳定,在推荐使用浓度下对花、果和叶片安全,是梨火疫病防治的主要药剂,但抗性菌株的出现和出于对人类健康安全考虑,一些国家禁止和限制链霉素的大田使用[4-8],我国于2018年6月农用硫酸链霉素已全面禁用[9]。铜制剂尤其是无机铜在有效防控浓度下对花、叶和果实易产生药害,在使用上受到一定限制。虽然还没有梨火疫病菌对铜制剂产生抗性的报道,但已有其他多种植物病原细菌对铜制剂抗性的报道,不能排除梨火疫病菌对铜制剂出现抗药性的可能性[7]。Georg等对29种药剂进行了梨火疫病防效测定,结果没有筛选出比链霉素更有效的药剂[10]。筛选新的有效药剂,创制新的复配药剂,提高防控效果,降低抗药性风险是梨火疫病防控的当务之急。本研究对目前广泛应用于植物细菌性病害防治的6种杀菌剂及其复配药剂进行梨火疫病菌室内毒力测定和在盆栽杜梨苗上进行防效试验,以期筛选出新的防治梨火疫病的有效药剂单剂和复配剂。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

梨火疫病菌XJSZ0102,由浙江大学生物技术研究所分离,经系统鉴定并保存于-70℃冰箱中。

1.2 供试药剂

供试杀菌剂包括6种原药和6种制剂。6种原药分别为:76.1%春雷霉素(日本北兴化学工业株式会社)、95%噻唑锌(浙江新农化工股份有限公司)、97%喹啉铜[兴农药业(中国)有限公司]、12%中生菌素(福建凯立生物制品有限公司)、98%丙硫唑(贵州道元生物技术有限公司)、50%芬母肽(江苏嘉泰生物技术有限公司);6种制剂分别为:40%春雷·噻唑锌悬浮剂、20%噻唑锌悬浮剂，浙江新农化工股份有限公司；45%春雷·喹啉铜悬浮剂、33.5%喹啉铜悬浮剂，兴农药业(中国)有限公司；2%春雷霉素水剂，江门市植保有限公司；10%丙硫唑悬浮剂，贵州道元生物技术有限公司。

1.3 供试杜梨苗

2018年秋移栽健康无病虫为害的一年生杜梨苗到苗盆(盆高20 cm,内径16 cm)中,置于新疆库尔勒市农业农村局育苗中心3号大棚内,生长季7～14 d浇1次透水,一个月施1次复合肥,2020年冬季平茬,2021年4月份新生枝条长至15 cm左右供试验用。

1.4 试验方法

1.4.1接种菌液的制备

从活化的平板上挑取梨火疫病菌单菌落到50 mL 营养肉汤(NB)培养基中,28℃、150 r/min振荡培养36 h。使用紫外可见光分光光度计测定菌悬液600 nm波长(OD600)吸光度,使用NB培养基稀释菌悬液至1×109cfu/mL (OD600为0.4±0.01)。

1.4.2杀菌剂原药溶解方法

95%噻唑锌原药先用适量二甲亚砜溶解,再用0.1%吐温-80稀释;98%丙硫唑原药先用适量冰醋酸溶解,再用0.1%吐温-80稀释;97%喹啉铜原药先用适量三氯甲烷溶解,再用0.1%吐温-80稀释;76.1%春雷霉素原药、12%中生菌素原药和50%芬母肽原药用无菌水溶解,使用0.22 μm无菌过滤器过滤后再用无菌水稀释。所有用于溶解原药的有机溶剂在培养基中的使用浓度都低于0.1%,在预试验中对梨火疫病菌生长的影响在统计误差范围内可忽略不计。

1.4.3杀菌剂原药对梨火疫病菌的毒力测定

采用比浊法室内测定6种杀菌剂对梨火疫病菌的毒力[11]。根据预试验,将6种杀菌剂原药稀释后加入到50 mL NB培养基中配成5个供试浓度(表1)。每个浓度设3个重复,每个重复1瓶,吸100 μL稀释100倍的接种菌液于含药培养基中,以相同浓度的含药培养基中加入等量无菌水代替菌悬液为组内空白对照。阳性对照以等量无菌水代替药剂,阴性对照以等量无菌水代替药剂和菌悬液。在28℃、150 r/min振荡培养36 h后测定培养液OD600增加值(ΔOD600,用组内空白对照调零后测定本组含药培养液的OD600)。

1.4.4混配药剂联合毒力测定

基于6种杀菌剂对梨火疫病菌的毒力结合每种杀菌机理,形成7个类别35种混配方案,采用比浊法进行联合毒力测定[12]。每种配比设5个供试浓度(表2),每个浓度设3个重复,每个重复1瓶,吸100 μL稀释100倍的接种菌液于含药培养基中,以相同浓度的含药培养基中加入等量无菌水代替菌悬液为组内空白对照。阳性对照以等量无菌水代替药剂,阴性对照以等量无菌水代替药剂和菌悬液。在28℃、150 r/min振荡培养36 h后测定培养液的ΔOD600,计算各混剂对梨火疫病菌的生长抑制率。

1.4.5在大棚盆栽杜梨苗上测定7种杀菌剂的防效

试验分两组,一组为预防试验,一组为治疗试验,每组设9个处理,包括7个药剂处理、1个接菌对照和1个空白对照。每个处理3个重复,每个重复10盆杜梨苗,为当年生枝条,在试验前5 d,修剪掉过长或过短的枝条,留下长势均匀一致长约15 cm的枝条。预防组先喷药,48 h后喷菌并覆膜保湿48 h;治疗组先喷菌并覆膜保湿48 h再喷药。根据供试药剂毒力测定结果结合生产厂家推荐使用倍数确定供试浓度(表3),每个处理用药量约1 L,喷至枝叶上药液悬而未滴;接菌采用喷雾方式,接菌浓度为1×109cfu/mL,接菌量约10 mL/盆。以只接菌不做药剂处理的为接菌对照,以既不接菌也不做药剂处理的为空白对照。

根据浙江大学生物技术研究所楼兵干教授制定的梨火疫病温室盆栽杜梨苗病情分级标准对接菌后14 d的盆栽苗进行调查,统计各病级发病枝条数。梨火疫病温室盆栽杜梨苗病级分级标准:0级,无病斑;1级,病斑长度占总枝条长度1/3及以下;3级,病斑长度占总枝条长度1/3以上,不超过2/3;5级,病斑长度占总枝条长度2/3以上。

1.4.6数据处理

根据公式(1)计算杀菌剂在室内对梨火疫病菌的生长抑制率。把杀菌剂浓度换算成对数值作为自变量x,把生长抑制率换算成抑制率几率值作为因变量y,使用SPSS统计分析软件进行回归分析,比较杀菌剂之间对梨火疫病菌的毒力差异。

生长抑制率=

(1)

根据公式(2)～(4)计算混剂的共毒系数(CTC)[12],根据CTC来评价药剂混配的增效作用,即CTC≥120时该复配剂表现增效,CTC≤80表现为拮抗,80

(2)

混剂理论毒力指数=TIA×PA+TIB×PB

(3)

式中TIA为A药剂的毒力指数,PA为A药剂在混剂中的百分含量,TIB为B药剂的毒力指数,PB为B药剂在混剂中的百分含量。

(4)

根据公式(5)(6)计算盆栽杜梨苗病情指数和杀菌剂在盆栽苗上对梨火疫病的防治效果。应用SPSS统计分析软件完成数据分析。

病情指数=

(5)

防治效果=

(6)

2 结果与分析

2.1 6种杀菌剂室内毒力测定结果

室内毒力测定结果(表1)表明:6种杀菌剂对梨火疫病菌都有生物活性。丙硫唑、芬母肽和中生菌素的EC50均低于1 mg/L,表现出很强的毒力;春雷霉素和噻唑锌的EC50大于1 mg/L小于50 mg/L,表现出较强的毒力;喹啉铜的EC50大于100 mg/L,毒力最弱。毒力方程的斜率反映了药剂对病原菌的急性毒作用带,斜率越大急性毒作用带越小,表示药效越好[13]。供试6种杀菌剂中梨火疫病菌急性毒作用带最小的药剂是芬母肽,其次是丙硫唑,中生菌素急性毒作用带最大。

表1 6种杀菌剂对梨火疫病菌的室内毒力测定Table 1 The toxicity of six single fungicides to Erwinia amylovora

2.2 混剂联合毒力测定结果

联合毒力测定结果(表2)表明:在供试的7类混剂中,春雷霉素和喹啉铜复配的5种混剂共毒系数均大于120,表现出增效作用;芬母肽和中生菌素复配的5种混剂共毒系数均小于80,表现出拮抗作用。在组成的35种混剂中,3个类别的9种混剂具有增效作用,其中增效最显著的混剂是春雷霉素∶喹啉铜=1∶9,CTC值为184,春雷霉素∶噻唑锌=1∶7的增效作用最弱,CTC值为120;8种混剂具有拮抗作用;18种混剂具有相加作用。

2.3 盆栽杜梨苗上防效测定结果

在具有增效作用的3类混剂中分别选择最优配比的混剂:40%春雷·噻唑锌悬浮剂(春雷霉素∶噻唑锌=1∶7)、45%春雷·喹啉铜悬浮剂(春雷霉素∶喹啉铜=1∶9)和2.1%丙硫·春雷悬浮剂(丙硫唑∶春雷霉素=1∶11),以及4种组成混剂的单剂在盆栽杜梨苗上测定对梨火疫病的防治效果。结果表明:3种混剂的预防效果和治疗效果均显著好于单剂(表3)。效果最好的是40%春雷·噻唑锌悬浮剂,预防效果和治疗效果分别为84.58%和74.37%;效果最差的是33.5%喹啉铜悬浮剂,预防效果和治疗效果分别为为40.88%和37.89%。

3 结论与讨论

本研究测定了6种杀菌剂原药对梨火疫病菌的毒力,结果除喹啉铜的EC50大于100 mg/L,毒力较弱外,其他5种杀菌剂都有较高的生物活性,其中芬母肽、丙硫唑和中生菌素生物活性最高。噻唑锌、中生菌素和芬母肽是我国近年来自主研发的创制药剂。噻唑锌对水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病等细菌性病害有很好的防治效果[14-15];室内毒力测定显示,中生菌素对核桃细菌性黑斑病菌Xanthomonasarboricolapv.juglandis、猕猴桃溃疡病菌Pseudomonassyringae有较好的生物活性,并且在田间对番茄溃疡病表现出较好的防治效果[16-18];芬母肽属于抗菌肽类杀菌剂,通过物理作用破坏细胞膜达到杀菌效果,对多种动植物病原细菌有很好的杀菌效果[19]。丙硫唑最早在临床上用于治疗蠕虫感染引起的疾病,后研究发现对多种植物病原真菌有较好的生物活性,在细菌性病害上的研究较少[20]。喹啉铜是铜制剂类的后起之秀,比碱式硫酸铜、氢氧化铜等无机铜更安全,对大麦条纹病、马铃薯疮痂病等多种病害有较好的防效[21-22]。上述5种药剂多数为近20年国内农药领域新的高效低毒药剂,在国际上很少有用于防治梨火疫病的文献报道。已有研究表明春雷霉素对梨火疫病菌的最低抑菌浓度为3.5～18.3 mg/L,EC95为6.9～46.7 mg/L[23],本研究结果与之一致。我们将春雷霉素和其他5种药剂的EC50比较,结果证明了各药剂对梨火疫病菌的有效性。

药剂联合毒力测定结果表明:所测试的7类35种混剂中只有3类9种药剂有增效作用。药剂混配通常有混剂和桶混两种方式。混剂是由农药生产厂家研发的含有两种及以上有效成分的农药制剂,桶混则是在田间施药时将几种单剂按比例配成混合药液。好的药剂混配不仅扩大了防治谱,降低了抗药性风险,同时具有增效作用,降低用药量,减少施药次数[24]。不是所用的药剂混配都具有增效作用,多数药剂混配表现出药效的相加,部分药剂混配后甚至表现出拮抗作用,本研究中芬母肽与中生菌素混配后就出现药剂间的拮抗作用。在田间施药时不能随意对不同药剂进行混配,以免出现药效降低的现象。药剂混配的效果不仅与药剂种类有关,也与混配比例相关,本研究中,春雷霉素和噻唑锌混配只有在春雷霉素∶噻唑锌=1∶7时有增效作用,其他比例都表现出相加作用,说明在混剂的研发过程中,混配比例至关重要,只有最佳的混配比例才能使混剂的药效发挥得最好。

表3 7种杀菌剂在盆栽杜梨苗上对梨火疫病的防治效果1)Table 3 Effects of seven fungicides against pear fire blight disease on potted seedlings

药剂Fungicide有效浓度/mg·L-1Effectiveconcentration预防试验Preventivetrial病情指数Diseaseindex预防效果/%Protectiveeffect治疗试验Therapeutictrial病情指数Diseaseindex治疗效果/%Treatmenteffect40%春雷·噻唑锌SCkasugamycin·zincthiazole40%SC333(9.29±0.42)f84.58(15.01±0.67)g74.3745%春雷·喹啉铜SCkasugamycin·oxine-copper45%SC300(9.84±0.14)f83.66(17.09±0.18)f70.822.1%丙硫·春雷SCalbendazole·kasugamycin2.1%SC133(13.90±0.27)e76.92(20.48±0.15)e65.032%春雷霉素ASkasugamycin2%AS40(19.90±0.51)c66.96(24.30±0.46)c58.5033.5%喹啉铜SCoxine-copper33.5%SC419(35.61±0.66)b40.88(36.37±0.60)b37.8920%噻唑锌SC zincthiazole20%SC500(19.69±0.49)c67.31(24.47±0.87)c58.2110%丙硫唑SC albendazole10%SC167(18.37±0.28)d69.50(22.87±0.93)d60.95接菌对照 Inoculationcontrol-(60.23±0.50)a-(58.56±1.77)a-空白对照 Blankcontrol-(0.00±0.00)g-(0.00±0.00)h-

大棚中盆栽杜梨苗上防治试验结果表明:筛选和混配的药剂对梨火疫病有一定防效且防效差异显著,混剂的防治效果显著好于单剂。药剂的大田防治效果不仅与杀菌剂有效成分的生物活性有关,还与药剂剂型加工有关[25]。为便于生产中应用,本研究所使用的单剂和混剂尽量选用市面上已有的商业化产品进行试验。40%春雷·噻唑锌悬浮剂是2015年国内新上市的产品,对水稻细菌性条斑病、水稻白叶枯病等都有较好的防治作用[26-27]。45%春雷·喹啉铜悬浮剂主要用于防治芒果、西瓜、黄瓜等作物的细菌性角斑病以及柑橘溃疡病等。上述两种药剂之前并未有梨火疫病防治方面的相关报道。本研究通过室内毒力测定、盆栽防效测定,明确了两种复配剂对梨火疫病的防治效果。丙硫唑和春雷霉素目前还没有商品化复配剂,本研究所用的药剂为使用现有单剂临时混配,虽然混剂在盆栽试验上表现出较好的防效,但作为制剂,还没有经过最佳的助剂配比和生产工艺研发,其防效有进一步提升的空间。