Kallistatin诱导SIRT1表达抑制人髓核细胞凋亡及细胞外基质降解

陆恩辉，李庆姝，谭 云

401336 重庆，重庆市东南医院骨科1；400010 重庆，重庆医科大学基础医学院病理科2

椎间盘退变是引起腰痛的主要原因[1-3]。椎间盘由髓核、纤维环和终板软骨组成。髓核细胞合成并分泌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，如糖胺聚糖(GAG)、蛋白聚糖(Aggrecan)和二型胶原(Collagen Ⅱ)来维持椎间盘的稳定性。目前认为，髓核细胞是椎间盘退变最早、最关键的因素[4]。髓核细胞过度凋亡导致椎间盘中细胞数量减少，ECM合成受损[5-7]。因此，抑制髓核细胞凋亡可能是抑制ECM降解、延缓椎间盘退变的有效手段。

人源性激肽释放酶结合蛋白(kallistatin，KS)是一种独特的丝氨酸蛋白酶抑制剂[8-10]，具有抑制血管生成、抗炎、抗氧化应激、抑制凋亡、纤维化和肿瘤进展等作用[11]。KS主要在肝脏表达，但也广泛分布于其他组织[12-13]。最近的研究表明，KS在人膝关节滑膜液中表达[14]，局部注射载有KS的腺病毒可通过降低炎症反应及细胞凋亡显著抑制骨关节炎的进展[15]。此外，KS还有延缓衰老的作用[16]。椎间盘退变是一种与衰老相关的疾病，炎症和凋亡也是椎间盘退变时髓核细胞的显著特征[17-19]。因此，我们推测KS可能在椎间盘退变进程中起着重要作用。

沉默信息调节因子2相关酶Ⅰ(silencing information regulator 2 related enzyme Ⅰ，SIRT1)是一种去乙酰化酶，与衰老、炎症和凋亡的调节相关[20-23]。既往研究证实，退变的椎间盘髓核中SIRT1显著降低[24]；SIRT1抑制髓核细胞凋亡，促进ECM合成[3,17,24]。最近研究表明，SIRT1是KS的重要下游靶点。GUO等[25]研究表明KS通过促进SIRT1延缓了血管老化。XIE等[26]研究证实KS通过调控SIRT1抑制心肌炎症和凋亡，减轻大鼠心力衰竭。但KS在人椎间盘退变过程中的作用尚未见报道。本研究试图揭示KS在椎间盘退变中的作用，并进一步阐明SIRT1在KS调控髓核细胞凋亡及细胞外基质合成中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源

所有标本取自东南医院2020年4月至2021年8月接受胸腰椎手术的患者。共纳入胸腰椎骨折患者5例(LVF组)，年龄24～41岁，平均36.4岁，男性3例，女性2例；腰椎间盘突出症患者12例(DDD组)，年龄26～42岁，平均37.2岁，男性7例，女性5例。所有患者术前经脊柱MRI扫描，根据Pfirrmann退变椎间盘矢状位MRI分级标准[27]，5例LVF患者椎间盘退变分级为0级或Ⅰ级，MRI(T2WI)显示椎间盘结构均匀，髓核与纤维换边界清楚，髓核信号等于脑脊液，椎间盘高度正常；12例DDD患者椎间盘退变分级为Ⅲ～Ⅴ级，MRI(T2WI)显示椎间盘结构不均匀，变黑，髓核与纤维换边界消失，髓核低信号，椎间盘高度降低(图1A)。本研究符合《赫尔辛基宣言》，并获得了东南医院伦理委员会的批准(CQDNYY-2020-0306)，所有患者在术前签署书面知情同意。

1.2 髓核的获取及细胞培养

所有椎间盘组织术中取出后立即装在氮气罐中带回实验室。用生理盐水仔细冲洗后，显微镜下分离髓核组织。0.25%胰酶37 ℃水浴箱中消化髓核组织30 min，然后用0.2% Ⅱ型胶原酶消化4 h。200目细胞筛过滤、离心(1 000 r/min)收获髓核细胞。按照JIANG等[17]描述的方法，在改良的Eagle’s培养基和Ham’s F-12培养基(DMEM/F12, 1∶1, Gibco, USA)中添加15% FBS和1%青霉素链霉素，37 ℃和5%CO2条件下培养髓核细胞。

1.3 药物、siRNA处理及分组

按照以往文献方法用H2O2增加髓核细胞凋亡率，减少ECM合成[3]。采用重组人Kallistatin(1 μmol/L, Abcam)处理髓核细胞[25]。用siRNA-SIRT1敲减髓核细胞中SIRT1的表达。根据是否使用H2O2/KS处理分为Control、H2O2、KS及H2O2+KS 4组；根据是否使用siRNA-SIRT1处理分为Control、H2O2、KS+H2O2、KS+H2O2+siRNA-NC及KS+H2O2+siRNA-SIRT1 5组。

1.4 siRNA-SIRT1转染髓核细胞

siRNA-SIRT1和阴性对照siRNA-NC购自Ambion(Fostor City, CA, USA)。将髓核细胞接种到6孔培养皿中，37℃孵育24h。然后按照制造商的说明转染siRNA-SIRT1和siRNA-NC。最后，收集处理后的细胞进行后续实验。

1.5 实时荧光定量PCR检测mRNA

使用Trizol Reagent (Invitrogen公司，15596-026)按照说明书从髓核组织和细胞中提取总RNA。遵循GARCIA等[28]的方法，用紫外分光光度计(Olympus, Japan)测定纯度和浓度后，用PrimeScript RT试剂Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, RR047Q)合成cDNA。最后，采用Taqman基因表达试剂盒(Applied Biosystems, USA)进行实时荧光定量PCR。反应条件为：95 ℃下3 min, 95 ℃下40次15 s的扩增循环，分别退火20 s, 72 ℃下延伸相20 s。引物均由TaKaRa合成。2-ΔΔCt表示mRNA的相对表达量，引物如表1所示。

表1 各基因引物序列

1.6 蛋白提取及Western blot检测

使用T-PERTM组织蛋白提取试剂(Thermo ScientificTM，78510)提取髓核组织蛋白。髓核细胞在冰的PBS(pH=7.5)中洗涤，使用RIPA裂解和提取缓冲液(Thermo ScientificTM，89900)进行裂解。裂解产物经十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)分离，转移到聚偏氟乙烯膜(PVDF) (Beyotime, FFP24)。用5%脱脂干乳在缓冲生理盐水(TBST)中封闭膜1 h，与一抗孵育:兔抗KS(1∶1 000, Abcam)，小鼠抗aggrecan(1∶1 000, Abcam)，兔抗Collagen Ⅱ(1∶1 000, Abcam)，兔抗cleaved Caspase 3(1∶1 000, Abcam)，兔抗cleaved Caspase 9(1∶1 000, Abcam)，兔抗Bcl2 (1∶1 000, Abcam)，兔抗sirt1(1∶1 000, Abcam)，鼠抗GAPDH(1∶1 000, Abcam)。然后清洗膜3次，二抗孵化1 h:山羊anti-rabbit IgG-HRP(1∶5 000，Abcam)和山羊anti-mouse IgG-HRP(1∶5 000，Abcam)。最后，ECL-plus(Invitrogen, WP20005)检测及分析结果。

1.7 流式检测细胞凋亡率

参照JIANG的方法[3]：0.25%胰酶消化离心收集细胞，PBS洗涤3次后重悬细胞，室温、避光条件下用Annexin V-FITC和PI孵育细胞15 min，1 h内用FACS Calibur流式细胞仪(BD公司，美国)检测凋亡率的变化情况。

1.8 GAG含量测定

用总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测髓核细胞GAG含量[29]。木瓜蛋白酶消化髓核细胞，根据525 nm处的光密度值计算GAG含量[3]。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 退变椎间盘髓核中KS表达较正常髓核明显降低

采用qRT-PCR和Western blot检测LVF组和DDD组患者髓核中KS的表达。结果显示，与LVF组相比，DDD组椎间盘髓核组织中KS的mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05，图1B、C)，表明KS可能在椎间盘退变进程中发挥重要作用。

A: LVF和DDD患者磁共振平扫，箭头示手术切除相应椎间盘；B: qRT-PCR检测LVF和DDD组髓核KS的mRNA含量；C: Western blot检测LVF和DDD组髓核KS的蛋白含量；a:P<0.05，与LVF比较

2.2 KS抑制H2O2诱导的髓核细胞凋亡

H2O2处理后KS的mRNA和蛋白表达量均显著降低(P<0.05，图2)，髓核细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，而KS+H2O2组髓核细胞凋亡率较H2O2组显著降低(P<0.05，图3A)。H2O2处理髓核细胞后，凋亡基因Caspase3、Caspase9和Bax mRNA及蛋白表达量明显升高，抗凋亡基因Bcl2表达量明显降低(P<0.05，图3B、C)。在H2O2预处理的基础上，经KS孵育后，Caspase3、Caspase9、Bax mRNA及蛋白表达水平降低，Bcl2表达恢复(P<0.05，图3B、C)。以上结果表明，KS对H2O2诱导的髓核细胞凋亡具有抑制作用。

2.3 KS抑制H2O2诱导的髓核细胞ECM降解

H2O2处理后，GAG含量显著降低，外源性加入KS后可以恢复GAG至接近正常水平(P<0.05，图4A)。H2O2+KS组Aggrecan和Collagen Ⅱ的mRNA表达显著高于H2O2组(P<0.05，图4B)。Western blot结果同样显示，H2O2+KS组Aggrecan和Collagen Ⅱ的蛋白表达显著高于H2O2组(P<0.05，图4C、D)。

A: qRT-PCR 检测两组髓核细胞KS的mRNA表达水平；B、C: Western blot 检测两组髓核细胞KS的蛋白表达水平；a: P<0.05

A: 流式细胞检测各组细胞凋亡率；B: qRT-PCR 检测各组Caspase3、Caspase9、Bcl2、Bax的mRNA表达水平；C: Western blot 检测各组Caspase3、Caspase9、Bcl2、Bax的蛋白表达水平；a:P<0.05

A: DMMB比色法定量检测各组髓核细胞GAG含量；B: qRT-PCR 检测各组髓核细胞Aggrecan和Collagen Ⅱ的mRNA表达水平；C: Western blot检测各组髓核细胞Aggrecan和Collagen Ⅱ的蛋白表达水平；a:P<0.05

2.4 SIRT1参与了KS对髓核细胞凋亡及ECM的调控

Western blot结果证实，siRNA-SIRT1有效减少了SIRT1的蛋白表达，H2O2处理降低了SIRT1蛋白的表达，而KS可以促进SIRT1的表达(图5A)。流式细胞检测结果显示siRNA-SIRT1抑制SIRT1表达后，加入KS不能减少细胞凋亡(图5B)。DMMB结果表明，KS不能挽救siRNA-SIRT1造成的髓核细胞GAG含量降低(图5C)。当SIRT1被抑制后，KS同样无法有效促进Aggrecan和Collagen Ⅱ的蛋白表达(图5D)。结果表明，KS对髓核细胞凋亡及ECM的调控与SIRT1的表达密切相关。

3 讨论

KS在众多组织细胞中均有表达，具有抑制氧化应激、炎症、凋亡和衰老等多种活性[10]。已有众多研究证实氧化应激、炎症、细胞凋亡和衰老是椎间盘退变的重要因素[5,30-31]，但目前尚没有KS在椎间盘中作用的报道。因此，本研究通过RT-PCR及Western blot检测正常及退变人椎间盘髓核中KS的表达情况，结果发现KS不仅在椎间盘髓核中表达，且随着椎间盘退变，KS表达明显降低，表明KS可能在椎间盘退变中起着重要作用。

椎间盘髓核细胞是合成细胞外基质(ECM)的主要细胞，髓核细胞过度凋亡导致ECM合成障碍是椎间盘退变的主要原因[3,17,32]。因此，抑制髓核细胞过度凋亡和ECM的降解可能是延缓椎间盘退变的重要途径。KS在心肌缺血再灌注、心肌梗死、高血压、脓毒症等疾病研究中显现出显著的抗凋亡作用[33]。本研究根据以往文献报道，采用H2O2诱导髓核细胞凋亡[3,34]。H2O2处理后髓核细胞凋亡率明显升高，同时Caspase3、Casepase9和Bax/Bcl2表达也明显增加，表明本研究通过H2O2处理获得了理想的髓核细胞凋亡模型。本研究发现，KS能有效降低H2O2诱导的髓核细胞凋亡率，并降低Caspase3、Casepase9和Bax/Bcl2的表达，结果表明KS可通过调控凋亡相关基因的活性显著抑制髓核细胞凋亡。本研究还发现，H2O2处理后髓核细胞GAG含量、Aggrecan和Collage Ⅱ的基因及蛋白表达均明显降低，表明H2O2处理不仅能有效造成髓核细胞凋亡模型，同时还能有效促进髓核细胞外基质的降解。在此基础上，额外补充KS后，GAG含量、Aggrecan和Collage Ⅱ的基因及蛋白表达均明显恢复至接近正常水平，表明KS能有效在体外抑制髓核细胞外基质的降解。以往研究表明，KS能有效抑制骨关节炎的发生发展[15]，而炎症是造成椎间盘髓核细胞退变、胞外基质降解的主要原因之一，因此本研究证实了KS对椎间盘髓核细胞外基质降解的抑制作用，与以往在关节炎中的研究结果相似。

1：Control组；2：H2O2组；3：H2O2组+KS组；4：H2O2组+KS+siRNA-NC组；5：H2O2组+KS+siRNA-SIRT1组

作为长寿基因，SIRT1可抑制多种细胞凋亡，促进细胞存活[35]。以往已经证实SIRT1在保护髓核细胞凋亡和抑制ECM降解中发挥着重要作用，SIRT1可通过AKT及ERK途径促进髓核细胞自噬活性、抑制髓核细胞凋亡，同时还能通过TLR2/SIRT1/NF-κB信号轴抑制氧化应激造成的髓核细胞外基质的降解[6,17,36]。近来研究表明，SIRT1是KS发挥各种保护性生理功能的核心机制。GUO等[25]报道了KS通过上调SIRT1表达来延缓血管衰老。XIE等[26]研究发现，KS可通过促进SIRT1抑制心肌炎症和凋亡，从而减轻大鼠心力衰竭。本研究结果表明，KS处理髓核细胞后，SIRT1含量明显增加，KS能有效挽救H2O2诱导的髓核细胞凋亡及ECM降解，但当髓核细胞中SIRT1被siRNA-SIRT1抑制后，KS就无法发挥保护细胞凋亡及ECM降解的作用。这些结果表明，SIRT1途径可能是KS抑制细胞凋亡和ECM降解的重要机制。

综上所述，本研究证实KS在椎间盘退变进程中扮演着重要角色，体外细胞实验证实其能通过诱导SIRT1表达从而抑制H2O2诱导的髓核细胞凋亡及ECM降解，但仍需后续动物体内实验进一步验证KS对椎间盘退变的保护作用。