传统发酵毛豆腐的研究进展

◎ 张继辉，赵丹丹

（芜湖职业技术学院 食品科学与生物工程学院，芜湖生命与健康工程研究中心，安徽 芜湖 241000）

毛豆腐是我国中部地区流行的豆类发酵食品，以皖南徽州地区生产的毛豆腐最具风味，是一种由霉菌发酵而成并由白色真菌菌丝覆盖的大豆蛋白豆腐，烹饪方法多样，味道鲜美。毛豆腐的生产一般以手工家庭作坊式生产为主，通过霉菌发酵制备而成，由于其是在自然环境下发酵，参与发酵的微生物种类多样，主要是毛霉。毛霉发酵制成的毛豆腐，提高了某些营养素的生物利用度，改变了豆腐的质地和风味。

1 毛豆腐加工工艺进展

1.1 传统加工工艺

徽州毛豆腐的传统制作工艺是用含有大量环境微生物的天然发酵豆腐酸水进行凝固，生产规模大部分以家庭作坊为主，如中国黄山市休宁县的方鑫玉家庭作坊一百多年来一直使用天然发酵豆腐酸水凝结剂生产毛豆腐。具体工艺为大豆浸泡过后研磨过滤制成豆浆，然后加热到80 ℃和天然发酵豆腐酸水 （pH ＜4.0）以1∶10的比例加入混凝。凝固后的豆浆静置15 min，使其完全凝固，将上层豆腐黄水过滤，纱布包裹豆腐后用双层磨具进行压片，最后切割后形成4 cm×4 cm×3 cm的豆腐砖。随后，在豆腐砖上喷洒毛霉孢子悬浮液[1-2]，在20 ℃的培养箱中放置4 d，湿度保持在90%左右，空气抽吸以确保通风。

1.2 现代加工工艺

毛豆腐制作的传统工艺一直以作坊式、经验式和发酵粗放式为主，受环境和人为因素影响大，产品质量参差不齐。有相关研究者检测出传统毛豆腐生产车间中菌落总数为4.5 lgCFU·m-3，杂菌污染会败坏毛豆腐的品质，还会引起有害物质如生物胺的累积，直接影响毛豆腐的口感[3-7]。国内对毛豆腐的现代加工工艺研究较少，部分学者从发酵条件和发酵菌种上进行了现代加工工艺的研究。

李然等[8]通过正交优化的方法探究了毛豆腐达到最佳食用品质时所需的发酵条件，结果显示发酵时间4 d、 发酵温度25 ℃、刷盐液浓度2%为最佳发酵条件，将刷盐液浓度为2%的豆腐胚在20 ℃的条件下培养4 d， 毛豆腐氨基酸态氮的含量随着发酵时间的延长不断增多。李婷婷[9]将毛霉菌LMM1和副干酪乳杆菌LMX1按1∶1的比例人工强化接种于豆腐胚表面，在15 ℃下恒温培养3 d可以得到发酵性状良好的毛豆腐。

2 毛豆腐制作过程中微生物菌群落结构研究

目前，关于毛豆腐的微生物学研究还不充分，但国内学者通过传统培养法、16s DNA测序以及宏基因组测序等方法对毛豆腐及制作过程中的微生物进行了鉴定、分离和研究。ZHAO等[10]研究发现毛霉是毛豆腐的主要发酵剂，毛豆腐的发酵受原料和环境因素的影响，包括温度、湿度、发酵时间和加工条件等。

王磊等[11]采用传统培养法从云南毛豆腐中分离得到总状毛霉、无根根霉、黄曲霉、白地霉和常见青霉，其中毛豆腐中的优势菌为无根根霉和总状毛霉。李婷婷[9]从传统徽州毛豆腐中分离筛选出一株产蛋白酶高大毛霉菌LMM1（Mucor mucedostrain LMM1 ）和一株产蛋白酶副干酪乳杆菌LMX1（Lactobacillus paracaseistrain LMX1），并按1∶1的比例人工强化接种于豆腐胚表面，在15 ℃下恒温培养3 d得到了发酵性状良好的毛豆腐。YAN等[1]利用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳技术鉴定了来源于毛豆腐传统发酵过程中的天然发酵酸水中的细菌。结果表明，厄尔纳拉乳杆菌（Lactobacillus ultunensis）、金肠球菌（Enterococcusbulliens）、格氏乳杆菌（Lactobacillus graminis）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、德氏乳杆菌亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis）和黏膜乳杆菌（Lactobacillus mucosae）是毛豆腐发酵的主要细菌。同时采用培养法从天然发酵酸水中分离出6种乳酸菌，并分析其产酸能力，发现德氏乳杆菌的乳酸含量最高，模拟混凝进一步证实德氏乳杆菌生产的豆腐砖质量最好，表明德氏乳杆菌可能是徽州毛豆腐传统生产过程中合成风味化合物的核心功能微生物。

BENUCCI等[12]采用高通量测序法对云南4个菜市场毛豆腐的真菌和细菌群落多样性进行了分析。结果表明，该地区毛豆腐大约由170个真菌和365个细菌类群组成，不同市场的微生物类群不同。真菌主要由子囊菌属（Ascomycota）、担子菌属（Basidiomycota）和毛菌属（Mucoromycota）组成，其中毛霉菌尤为丰富，也与之前的研究结论相符合。毛霉菌通过蛋白质水解过程和营养物质的释放影响最终产品的质量[10-13]。细菌群落以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）为主。在所有类群中，几乎所有样本中都存在属于乳酸菌的乳杆菌属（Lactobacillus）和明串珠菌属（Leuconostoc），这些细菌在发酵食品中普遍存在，并已报道在大豆发酵产品中存在，且具有抗菌和抗氧化特性、清除自由基和产生活性肽的功能[14-15]。

3 毛豆腐发酵的主要影响因素

3.1 发酵温度

发酵温度是毛豆腐发酵过程中的关键因素，微生物的生长也受温度的直接控制，同时微生物所释放的蛋白酶类催化活性也与温度密切相关。豆腐蛋白在发酵过程中被微生物酶水解为低分子量的多肽，这些化合物具有生物活性[16]。此外，部分多肽及其释放的氨还能转化为酸、醇等多种挥发性风味化合物，直接决定了毛豆腐的风味和品质[17]。然而，自然发酵的毛豆腐由于温度难以控制，导致成品质量参差不齐，风味不一。李然等[8]通过正交试验对发酵条件进行优化，得出20 ℃下发酵的毛豆腐感官评分最高，这也与休宁方鑫玉家庭作坊传统发酵工艺的发酵温度一致[1]。李婷婷等[9]将高大毛霉菌LMM1与副干酪乳杆菌LMX1以1∶1比例混菌接种发酵，发现发酵温度为15 ℃时培养的毛豆腐综合评分最高。以上研究均为毛豆腐发酵温度的确定提供了技术参考。

3.2 发酵时间

发酵时间决定了毛豆腐的发酵程度。发酵时间较短，豆腐蛋白未能及时被微生物释放的蛋白酶分解，风味物质释放不充分，导致发酵不充分，成品没有发酵过后的醇香；发酵时间过长则会导致成品过熟，从而发生腐败，影响成品质量。毛豆腐传统发酵工艺的发酵时间一般为3～7 d，具体根据发酵温度和菌丝生长情况而定。李然等[8]通过正交试验得出最佳发酵时间为4 d，与传统发酵工艺发酵时间一致[1]。李婷婷等[9]使用混菌接种发酵得出最佳发酵时间为3 d，时间缩短可能与接种菌剂有直接关系。

4 毛豆腐发酵过程中理化指标分析

4.1 毛豆腐的质地变化

在毛豆腐发酵过程中其质地会发生明显的变化。ZHAO等[10]对毛豆腐质地特征分析的结果表明，随着发酵过程的延长，毛豆腐的黏附性呈增加趋势，硬度、内聚性和弹性呈降低趋势。毛豆腐发酵过程中水分流失导致蛋白质浓度增加，黏附性增加。随着发酵时间的延长，大豆蛋白被毛霉菌分泌的蛋白酶降解为低分子量的蛋白片段，破坏了蛋白质形成的网络结构，可能导致毛豆腐硬度的降低。内聚性是描述刺激构成产品主体的内部键强度所需的力的参数，由于发酵过程中发生了蛋白质水解，构成蛋白质基质的键的数量和强度被破坏，因此发酵毛豆腐的内聚性明显低于未发酵的豆腐[18]。毛豆腐弹性的降低可能与水分的降低也有直接关系，这是因为水是一种增塑剂，弹性可能会随着水分的减少而降低[19]。

4.2 毛豆腐的营养成分

豆制品本身的营养成分十分丰富，含有40%左右的蛋白质、18%的脂肪、25%的碳水化合物、5%的矿物质以及丰富的B族维生素等[20]。发酵以后豆制品中的大分子物质，如蛋白质、脂类以及碳水化合物在酶的作用下水解为肽、氨基酸、脂肪酸和单糖等小分子物质，这些小分子物质是形成发酵豆制品特殊风味的关键物质[21]。

水溶性蛋白质和氨基氮是黄山毛豆腐的主要营养成分。YAN等[1]研究发现随着真菌在发酵过程中的生长代谢，蛋白酶水平逐渐升高，蛋白质被降解为蛋白胨、多肽、氨基酸等微生物生长的中间体。因此，随着发酵的进行，可溶性蛋白的总体含量逐渐增加。同样，在发酵过程中，由于真菌蛋白酶介导水解豆腐蛋白，导致氨基酸氮含量增加。毛豆腐作为一种典型的发酵大豆产品具有更强的抗氧化和抗肿瘤特性[22]。有研究也报道了发酵豆制品除了具有免疫功能外，还对高血压、糖尿病和炎症也有显著的治疗作用[23]。毛豆腐的鲜味浓郁主要是因为它含有谷氨酸等多种氨基酸，氨基氮含量的增加对毛豆腐风味的改善起到了关键作用。

此外，YAN等[1]还发现毛豆腐的还原糖含量在发酵过程中先增加后降低，最初的增加可能是由于豆腐淀粉被淀粉酶水解，随着真菌的增殖，还原糖成为碳和能量的主要来源。同时，还原糖还参与了谷氨酸等氨基酸的生成，导致其在发酵2 d后含量下降。大豆总碳水化合物含量约为25%～30%，主要包括淀粉、低聚糖和膳食纤维，其中低聚糖占总碳水化合物的10%。大豆低聚糖的主要糖类是棉子糖和蔗糖，不能被人体直接消化吸收[24]。然而，真菌生长过程中所释放的α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和α-半乳糖苷酶等，最终会将多糖分解为糊精和低聚糖，再进一步分解为葡萄糖和其他易被利用的糖，从而大大提高了毛豆腐中多糖的利用率。

发酵微生物在代谢过程中产生的脂肪酶将大豆中的脂类物质逐级降解为小分子的酯、脂肪酸和醇类物质。毛豆腐也不例外，在发酵的过程中一部分脂肪酸在其他酶类的协同作用下进一步分解为小分子的挥发性醛、酸或醇类物质，另一部分脂肪酸和醇类结合形成芳香族化合物，赋予毛豆腐特有的香气[25]。

4.3 毛豆腐的挥发性成分

毛豆腐因其独特的发酵工艺而具有特殊的风味，挥发性物质是毛豆腐发酵过程中的主要风味物质，这些风味物质是由发酵过程中各种酶促反应产生的[26]。YAN等[1]在黄山毛豆腐中鉴定和定量了44种挥发性化合物，包括9种酯、9种酸、8种醇、5种醛、4种烯烃、3种酮、2种苯、2种酚、1种呋喃和1种吲哚。样品毛豆腐挥发性化合物总量为3.156～16.016 μg·g-1， 发酵过程中所有样品的主要化合物为醇和酸，这些化合物大部分在其他发酵食品如酱油、大酱和韩国大酱中均有报道[27-29]。其中，酸性物质对黄山毛豆腐的风味有重要影响。有研究表明发酵培养基中有机酸的存在抑制了污染细菌的生长，增加了发酵产品的醇厚、回味和风味[30]。而毛豆腐中的醇以1-辛烯-3-醇、苯乙醇和庚醇最为常见，其中1-辛烯-3-醇含量尤其丰富。1-辛烯-3-醇是真菌中普遍存在的挥发性化合物，其也存在于豆科植物中[31-32]，有研究者从米酒、小麦曲和清酒曲中也分离得到了1-辛烯-3-醇[33]。

毛豆腐中还含有醛类、酮类和酚类等挥发性物质。其中，苯甲醛是黄山毛豆腐中最重要的一种醛，它赋予毛豆腐苦杏仁的香气。苯甲醛的形成是苯甲醇氧化的结果，或是芳香族氨基酸（如苯基羟基苯甲酸和对乙酸）的微生物分解的结果。毛豆腐中的挥发性酚类物质有愈创木酚和苯酚，愈创木酚赋予发酵豆腐辛辣和烟熏的香气，该物质主要通过对香豆酸和阿魏酸的酶促或热脱羧形成的[34]。

5 结语

目前，徽州毛豆腐依然以手工作坊的生产方式为主，发酵条件靠经验把控，发酵技术靠代代相传，没有形成具体的生产标准，导致生产的产品质量不一，经不起考量。自然发酵受环境影响巨大，环境中微生物种类复杂多样，接种时具有不确定性和不稳定性，直接影响毛豆腐的品质。同时手工生产限制了毛豆腐的扩大生产和销售，直接阻碍了产业的发展。因此，应继续加大对毛豆腐发酵过程中微生物群落多样性的研究，筛选出有益发酵菌种，进行定向接种发酵，控制产品品质。生产方式应逐渐从家庭作坊式向机械化方向发展，采用手工作坊和机械化相结合的生产方式，既能保留手工作坊式生产的特殊风味，又能增产增量，扩大市场。此外，还应调整毛豆腐产业的结构，加强毛豆腐的豆腐胚制作、发酵、销售等环节的标准化，打造毛豆腐的特色效益等是现阶段对毛豆腐家庭作坊及企业的重大考验，也将直接影响整个产业的发展。